בידוד, אפיון ויישום טיפולי של שלפוחיות חוץ-תאיות מתאי גזע מזנכימליים אנושיים בתרבית
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הצנטריפוגה הדיפרנציאלית לבידוד ואפיון כלי רכב חשמליים מייצגים (אקסוזומים ומיקרובוסיקלים) מתאי MSC אנושיים מתורבתים. יישומים נוספים של כלי רכב חשמליים אלה מוסברים גם במאמר זה.
Abstract
שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן ננו-חלקיקי קרום הטרוגניים המשוחררים על ידי רוב סוגי התאים, והם מוכרים יותר ויותר כרגולטורים פיזיולוגיים של הומאוסטזיס אורגניזם ואינדיקטורים חשובים לפתולוגיות; בינתיים, הפוטנציאל העצום שלהם לבסס טיפולים נגישים וניתנים לשליטה במחלות הולך וגדל. תאי גזע מזנכימליים (MSCs) יכולים לשחרר כמויות גדולות של כלי רכב חשמליים בתרבית, אשר הראו הבטחה להתניע התחדשות רקמות יעילה ולהקל על יישומים טיפוליים נרחבים עם מדרגיות טובה ויכולת שחזור. קיים ביקוש גובר לפרוטוקולים פשוטים ויעילים לאיסוף ויישום MSC-EVs. כאן, פרוטוקול מפורט מסופק המבוסס על צנטריפוגה דיפרנציאלית כדי לבודד ולאפיין כלי רכב חשמליים מייצגים מתאי MSC אנושיים מתורבתים, אקסוזומים ומיקרו-שלפוחיות ליישומים נוספים. יכולת ההסתגלות של שיטה זו מוצגת עבור סדרה של גישות במורד הזרם, כגון תיוג, השתלה מקומית והזרקה מערכתית. יישום נוהל זה ייתן מענה לצורך באיסוף ויישום פשוט ואמין של MSC-EVs במחקר תרגומי.
Introduction
תאי גזע הם תאים פלוריפוטנטיים בלתי ממוינים בעלי יכולת התחדשות עצמית ופוטנציאל תרגום1. תאי גזע מזנכימליים (MSCs) מבודדים, מתורבתים, מורחבים ומטוהרים בקלות במעבדה, מה שנשאר אופייני לתאי גזע לאחר מעברים מרובים. בשנים האחרונות, עדויות הולכות וגדלות תומכות בדעה כי MSCs לפעול במצב paracrine בשימוש טיפולי 2,3. במיוחד הפרשת שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) ממלאת תפקיד מכריע בתיווך הפונקציות הביולוגיות של MSCs. כננו-חלקיקים קרומיים הטרוגניים המשתחררים מרוב סוגי התאים, כלי רכב חשמליים מורכבים מתת-קטגוריות הנקראות אקסוזומים (Exos), מיקרו-שלפוחיות (MVs), וגופים אפופטוטיים גדולים עוד יותר 4,5. ביניהם, Exos הוא EV הנחקר ביותר עם גודל של 40-150 ננומטר, שהוא ממוצא אנדוזומלי מופרש באופן פעיל בתנאים פיזיולוגיים. MVs נוצרים על ידי שפיכה ישירות מפני השטח של קרום פלזמה התא בקוטר של 100-1,000 ננומטר, אשר מאופיינים ביטוי גבוה של פוספטידיל סרין ביטוי של סמנים פני השטח של תאים תורמים6. כלי רכב חשמליים מכילים רנ”א, חלבונים ומולקולות ביו-אקטיביות אחרות, שיש להן תפקידים דומים לתאי האב וממלאות תפקיד משמעותי בתקשורת התא, בתגובה החיסונית ובתיקון נזק לרקמות7. MSC-EVs נחקרו באופן נרחב ככלי טיפולי רב עוצמה ללא תאים ברפואה רגנרטיבית8.
בידוד וטיהור של כלי רכב חשמליים שמקורם ב-MSC הוא נושא נפוץ בתחום המחקר והיישום. כיום, אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית וצפיפות שיפוע9, תהליך אולטרה-סינון 10, הפרדה אימונומגנטית 11, כרומטוגרף הדרה מולקולרית12 ושבב מיקרופלואידי13 הן שיטות בשימוש נרחב בבידוד וטיהור של כלי רכב חשמליים. עם היתרונות והחסרונות של כל גישה, לא ניתן לספק את הכמות, הטוהר והפעילות של כלי רכב חשמליים שנאספו בו זמנית14,15. במחקר הנוכחי מוצג בפירוט פרוטוקול הצנטריפוגה הדיפרנציאלית של בידוד ואפיון של כלי רכב חשמליים מתאי MSC מתורבתים, אשר תמך בשימוש טיפולי יעיל 16,17,18,19,20. יכולת ההסתגלות של שיטה זו לסדרה של גישות במורד הזרם, כגון תיוג פלואורסצנטי, השתלה מקומית והזרקה מערכתית, הוכחה עוד יותר. יישום נוהל זה ייתן מענה לצורך באיסוף ויישום פשוט ואמין של MSC-EV במחקר תרגומי.
Protocol
Representative Results
Discussion
כלי רכב חשמליים ממלאים תפקיד חשוב בפעילויות ביולוגיות מגוונות, כולל הצגת אנטיגן, הובלת חומרים גנטיים, שינוי מיקרו-סביבה של תאים ועוד. יתר על כן, היישום הרחב שלהם מביא גישות חדשות והזדמנויות לאבחון וטיפול במחלות21. יישום יישומים טיפוליים של כלי רכב חשמליים מבוסס על בידוד ואפיון…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32000974, 81930025 ו-82170988) ומהקרן הסינית למדע פוסט-דוקטורט (2019M663986 ו-BX20190380). אנו אסירי תודה על הסיוע של המרכז הלאומי להדגמת הוראה ניסויית לרפואה בסיסית (AMFU) והמעבדה המרכזית לניתוח ובדיקות של המרכז לחדשנות רפואית צבאית של האוניברסיטה הרפואית של חיל האוויר.
Materials
| 10% povidone-iodine (Betadine) | Weizhenyuan | 10053956954292 | Wound disinfection |
| Calibration solution | Particle Metrix | 110-0020 | Calibrate the NTA instrument |
| Carprofen | Sigma | 53716-49-7 | Analgesic medicine |
| Caudal vein imager | KEW Life Science | KW-XXY | Caudal vein imager |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418R | Centrifugation |
| Fatal bovine serum | Corning | 35-081-CV | Culture of UCMSCs |
| Formvar/carbon-coated square mesh | PBL Assay Science | 24916-25 | Transmission electron microscope |
| Heating pad | Zhongke Life Science | Z8G5JBMz | Post-treatment care of animals |
| Heparin Solution | StemCell | 7980 | Systemic injection |
| Isoflurane | RWD Life Science | R510-22 | Animal anesthesia |
| Minimum Essential Medium Alpha basic (1x) | Gibco | C12571500BT | Culture of UCMSCs |
| Nanoparticle tracking analyzer | Particle Metrix | ZetaView PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
| PBS (1x) | Meilunbio | MA0015 | Resuspend EVs |
| Penicillin/Streptomycin | Procell Life Science | PB180120 | Culture of UCMSCs |
| Phosphotungstic acid | Solarbio | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
| Pipette | Eppendorf | 3120000224 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma-Aldrich | MINI26 | Labeling EVs |
| Skin biopsy punch | Acuderm | 69038-10-50 | Skin defects |
| Software ZetaView | Particle Metrix | Version 8.05.14 SP7 | |
| Thermostatic equipment | Grant | v-0001-0005 | Water bath |
| Transmission electron microscope | HITACHI | HT7800 | Transmission electron microscope |
| UCMSCs | Bai'ao | UKK220201 | Commercially UCMSCs |
| Ultracentrifuge | Beckman | XPN-100 | Centrifugation |
| Ultrapure filtered water purification system | Milli-Q | IQ 7000 | Preparation of ultrapure water |
Riferimenti
- Liu, S., et al. The application of MSCs-derived extracellular vesicles in bone disorders: Novel cell-free therapeutic strategy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 619 (2020).
- Arthur, A., Zannettino, A., Gronthos, S. The therapeutic applications of multipotential mesenchymal/stromal stem cells in skeletal tissue repair. Journal of Cellular Physiology. 218 (2), 237-245 (2009).
- Zhou, Y., Yamamoto, Y., Xiao, Z., Ochiya, T. The immunomodulatory functions of mesenchymal stromal/stem cells mediated via paracrine activity. Journal of Clinical Medicine. 8 (7), 1025 (2019).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Mori, M. A., Ludwig, R. G., Garcia-Martin, R., Brandao, B. B., Kahn, C. R. Extracellular miRNAs: From Biomarkers to Mediators of Physiology and Disease. Cell Metabolism. 30 (4), 656-673 (2019).
- Lei, L. M., et al. Exosomes and Obesity-Related Insulin Resistance. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 651996 (2021).
- Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism. Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).
- Gatti, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols In Cell Biology. , 22 (2006).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).
- Zarovni, N., et al. Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches. Methods. 87, 46-58 (2015).
- Boing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Chen, I. H., et al. Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 3175-3180 (2017).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Liu, S., et al. MSC Transplantation Improves Osteopenia via Epigenetic Regulation of Notch Signaling in Lupus. Cell Metabolism. 22 (4), 606-618 (2015).
- Deng, C. L., et al. Photoreceptor protection by mesenchymal stem cell transplantation identifies exosomal MiR-21 as a therapeutic for retinal degeneration. Cell Death and Differentiation. 28 (3), 1041-1061 (2021).
- Wu, M., et al. SHED aggregate exosomes shuttled miR-26a promote angiogenesis in pulp regeneration via TGF-beta/SMAD2/3 signalling. Cell Proliferation. 54 (7), 13074 (2021).
- Qiu, X., et al. Exosomes released from educated mesenchymal stem cells accelerate cutaneous wound healing via promoting angiogenesis. Cell Proliferation. 53 (8), 12830 (2020).
- He, X., et al. MSC-derived exosome promotes M2 polarization and enhances cutaneous wound healing. Stem Cells International. 2019, 7132708 (2019).
- Cheng, L., Hill, A. F. Therapeutically harnessing extracellular vesicles. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (5), 379-399 (2022).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Nielsen, T., et al. Extracellular vesicle-associated procoagulant phospholipid and tissue factor activity in multiple myeloma. PLoS One. 14 (1), 0210835 (2019).
- Zheng, C., et al. Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109 (2021).
- Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).
- Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 9533 (2020).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. Strategies for isolation of exosomes. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6, 36162 (2016).
- Williams, A. M., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes provide neuroprotection and improve long-term neurologic outcomes in a swine model of traumatic brain injury and hemorrhagic shock. Journal of Neurotrauma. 36 (1), 54-60 (2019).
- Li, Z., et al. Apoptotic vesicles activate autophagy in recipient cells to induce angiogenesis and dental pulp regeneration. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 1525 (22), 00304-00305 (2022).
- Nozaki, T., et al. Significance of a multiple biomarkers strategy including endothelial dysfunction to improve risk stratification for cardiovascular events in patients at high risk for coronary heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 54 (7), 601-608 (2009).
- Qi, Y., Ma, J., Li, S., Liu, W. Applicability of adipose-derived mesenchymal stem cells in treatment of patients with type 2 diabetes. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 274 (2019).
- Kumar, A., et al. High-fat diet-induced upregulation of exosomal phosphatidylcholine contributes to insulin resistance. Nature Communications. 12 (1), 213 (2021).
