Isolering, karakterisering og terapeutisk anvendelse av ekstracellulære vesikler fra dyrkede humane mesenkymale stamceller

Summary

Den nåværende protokollen beskriver differensialsentrifugeringen for isolering og karakterisering av representative EV (eksosomer og mikrovesikler) fra dyrkede humane MSC-er. Ytterligere anvendelser av disse elbilene er også forklart i denne artikkelen.

Abstract

Ekstracellulære vesikler (EV) er heterogene membrannanopartikler frigjort av de fleste celletyper, og de blir stadig mer anerkjent som fysiologiske regulatorer av organisatorisk homeostase og viktige indikatorer på patologier; I mellomtiden vokser deres enorme potensial for å etablere tilgjengelige og kontrollerbare sykdomsbehandlinger fram. Mesenkymale stamceller (MSC) kan frigjøre store mengder EV i kultur, som har vist løfte om å starte effektiv vevregenerering og legge til rette for omfattende terapeutiske applikasjoner med god skalerbarhet og reproduserbarhet. Det er en økende etterspørsel etter enkle og effektive protokoller for innsamling og anvendelse av MSC-EV-er. Her er det gitt en detaljert protokoll basert på differensiell sentrifugering for å isolere og karakterisere representative elbiler fra dyrkede humane MSC-er, eksosomer og mikrovesikler for videre anvendelser. Tilpasningsevnen til denne metoden er vist for en rekke nedstrøms tilnærminger, for eksempel merking, lokal transplantasjon og systemisk injeksjon. Implementeringen av denne prosedyren vil adressere behovet for enkel og pålitelig MSC-EVs innsamling og anvendelse i translasjonsforskning.

Introduction

Stamceller er udifferensierte pluripotente celler med selvfornyelsesevne og translasjonspotensial¹. Mesenkymale stamceller (MSC) blir lett isolert, dyrket, utvidet og renset i laboratoriet, som forblir karakteristisk for stamceller etter flere passasjer. I de senere år har økende bevis støttet synspunktet om at MSC opptrer i en parakrin modus ved terapeutisk bruk ^2,3. Spesielt sekresjonen av ekstracellulære vesikler (EV) spiller en avgjørende rolle i formidling av MSCs biologiske funksjoner. Som heterogene membranøse nanopartikler frigjort fra de fleste celletyper, består EV av underkategorier kalt eksosomer (Exos), mikrovesikler (MV) og enda større apoptotiske legemer ^4,5. Blant dem er Exos den mest studerte EV med en størrelse på 40-150 nm, som er av endosomal opprinnelse og aktivt utskilt under fysiologiske forhold. MVer dannes ved å kaste direkte fra overflaten av celleplasmamembranen med en diameter på 100-1000 nm, som er preget av høyt uttrykk av fosfatidylserin og ekspresjon av overflatemarkører av donorceller⁶. EV inneholder RNA, proteiner og andre bioaktive molekyler, som har lignende funksjoner som foreldrecellene og spiller en betydelig rolle i cellekommunikasjon, immunrespons og reparasjon av vevskader⁷. MSC-EV har blitt mye undersøkt som et kraftig cellefritt terapeutisk verktøy i regenerativ medisin⁸.

Isolering og rensing av MSC-avledede elbiler er et vanlig problem innen forskning og anvendelse. For tiden er differensial- og tetthetsgradient ultrasentrifugering⁹, ultrafiltreringsprosess¹⁰, immunomagnetisk separasjon 11, molekylær eksklusjonskromatograf 12 og mikrofluidisk chip¹³ mye brukte metoder i isolering og rensing av EV. Med fordelene og ulempene ved hver tilnærming, kan mengden, renheten og aktiviteten til innsamlede elbiler ikke tilfredsstilles samtidig^14,15. I denne studien er differensialsentrifugeringsprotokollen for isolasjon og karakterisering av elbiler fra dyrkede MSC-er vist i detalj, noe som har støttet effektiv terapeutisk bruk 16,17,18,19,20. Tilpasningsevnen til denne metoden for en rekke nedstrøms tilnærminger, som fluorescerende merking, lokal transplantasjon og systemisk injeksjon, har videre blitt eksemplet. Implementering av denne prosedyren vil adressere behovet for enkel og pålitelig innsamling og anvendelse av MSC-EVs i translasjonsforskning.

Protocol

Alle dyreprosedyrer ble godkjent av Animal Care and Use Committee ved det fjerde militære medisinske universitetet og utført i samsvar med National Institutes of Health Guide for pleie og bruk av forsøksdyr. Åtte uker gamle C57Bl/6-mus (ingen preferanse for verken hunner eller hanner) ble brukt. Kryopreserverte humane navlestrengsavledede MSC (UCMSC), brukt til denne studien, ble hentet fra en kommersiell kilde (se materialtabell). Bruken av humane celler ble godkjent av etikkomiteen for fjerde milit…

Representative Results

MV-er og Exo-er fra dyrkede humane UCMSC-er isoleres etter den eksperimentelle arbeidsflyten (figur 1). NTA-resultatene viser at størrelsen på Exos fra menneskelige MSCer varierer fra 40 nm til 335 nm med en toppstørrelse på ca. 100 nm, og størrelsen på MVer varierer fra 50 nm til 445 nm med en toppstørrelse på 150 nm (figur 2). Morfologisk karakterisering av MSC-avledet Exos viser en typisk koppform (figur 3). Elbiler merke…

Discussion

Elbiler dukker opp til å spille en viktig rolle i ulike biologiske aktiviteter, inkludert antigenpresentasjon, transport av genetisk materiale, modifisering av cellemikromiljø og andre. Videre gir deres brede anvendelse nye tilnærminger og muligheter for diagnostisering og behandling av sykdommer²¹. Implementering av terapeutiske anvendelser av elbiler er basert på vellykket isolering og karakterisering. På grunn av mangelen på standardiserte isolasjons- og rensemetoder og den lave utvinning…

Materials

10% povidone-iodine (Betadine)	Weizhenyuan	10053956954292	Wound disinfection
Calibration solution	Particle Metrix	110-0020	Calibrate the NTA instrument
Carprofen	Sigma	53716-49-7	Analgesic medicine
Caudal vein imager	KEW Life Science	KW-XXY	Caudal vein imager
Centrifuge	Eppendorf	5418R	Centrifugation
Fatal bovine serum	Corning	35-081-CV	Culture of UCMSCs
Formvar/carbon-coated square mesh	PBL Assay Science	24916-25	Transmission electron microscope
Heating pad	Zhongke Life Science	Z8G5JBMz	Post-treatment care of animals
Heparin Solution	StemCell	7980	Systemic injection
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22	Animal anesthesia
Minimum Essential Medium Alpha basic (1x)	Gibco	C12571500BT	Culture of UCMSCs
Nanoparticle tracking analyzer	Particle Metrix	ZetaView PMX120	Nanoparticle tracking analysis
PBS (1x)	Meilunbio	MA0015	Resuspend EVs
Penicillin/Streptomycin	Procell Life Science	PB180120	Culture of UCMSCs
Phosphotungstic acid	Solarbio	12501-23-4	Transmission electron microscope
Pipette	Eppendorf	3120000224
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit	Sigma-Aldrich	MINI26	Labeling EVs
Skin biopsy punch	Acuderm	69038-10-50	Skin defects
Software ZetaView	Particle Metrix	Version 8.05.14 SP7
Thermostatic equipment	Grant	v-0001-0005	Water bath
Transmission electron microscope	HITACHI	HT7800	Transmission electron microscope
UCMSCs	Bai'ao	UKK220201	Commercially UCMSCs
Ultracentrifuge	Beckman	XPN-100	Centrifugation
Ultrapure filtered water purification system	Milli-Q	IQ 7000	Preparation of ultrapure water