В настоящем протоколе описывается дифференциальное центрифугирование для выделения и характеристики репрезентативных ВВ (экзосом и микровезикул) из культивируемых МСК человека. Дальнейшее применение этих электромобилей также объясняется в этой статье.
Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой гетерогенные мембранные наночастицы, высвобождаемые большинством типов клеток, и они все чаще признаются физиологическими регуляторами гомеостаза организма и важными индикаторами патологий; В то же время появляется их огромный потенциал для создания доступных и контролируемых методов лечения заболеваний. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) могут высвобождать большое количество EV в культуре, что обещает ускорить эффективную регенерацию тканей и облегчить обширное терапевтическое применение с хорошей масштабируемостью и воспроизводимостью. Существует растущий спрос на простые и эффективные протоколы для сбора и применения MSC-EV. Здесь представлен подробный протокол, основанный на дифференциальном центрифугировании, для выделения и характеристики репрезентативных EV из культивируемых человеческих МСК, экзосом и микровезикул для дальнейшего применения. Показана адаптивность этого метода для ряда последующих подходов, таких как маркировка, местная трансплантация и системная инъекция. Реализация этой процедуры позволит удовлетворить потребность в простом и надежном сборе и применении MSC-EV в трансляционных исследованиях.
Стволовые клетки представляют собой недифференцированные плюрипотентные клетки со способностью к самообновлению и трансляционным потенциалом1. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) легко выделяются, культивируются, расширяются и очищаются в лаборатории, что остается характерным для стволовых клеток после многократного прохождения. В последние годы появляется все больше данных, подтверждающих мнение о том, что МСК действуют в паракринном режиме при терапевтическом использовании 2,3. В частности, секреция внеклеточных везикул (ВВ) играет решающую роль в опосредовании биологических функций МСК. Как гетерогенные мембранные наночастицы, высвобождаемые из большинства типов клеток, EV состоят из подкатегорий, называемых экзосомами (Exos), микровезикулами (MV) и даже более крупными апоптотическими телами 4,5. Среди них наиболее широко изученным ЭВ размером 40-150 нм является Exos, который имеет эндосомальное происхождение и активно секретируется в физиологических условиях. МВ образуются путем осыпания непосредственно с поверхности клеточной плазматической мембраны диаметром 100-1000 нм, которые характеризуются высокой экспрессией фосфатидилсерина и экспрессией поверхностных маркеров донорскихклеток6. EV содержат РНК, белки и другие биологически активные молекулы, которые имеют функции, аналогичные родительским клеткам, и играют важную роль в клеточной коммуникации, иммунном ответе и восстановлении повреждений тканей7. MSC-EV широко исследовались как мощный бесклеточный терапевтический инструмент в регенеративной медицине8.
Выделение и очистка электромобилей, полученных из MSC, является распространенной проблемой в области исследований и применения. В настоящее время дифференциальное ультрацентрифугирование и градиентплотности 9, процессультрафильтрации 10, иммуномагнитная сепарация11, хроматограф 12 молекулярного исключения и микрофлюидный чип13 широко используются при выделении и очистке электромобилей. Учитывая преимущества и недостатки каждого подхода, количество, чистота и активность собранных электромобилей не могут быть удовлетворены одновременно14,15. В настоящем исследовании подробно показан протокол дифференциального центрифугирования выделения и характеристики ЭВ из культивируемых МСК, который поддерживает эффективное терапевтическое использование 16,17,18,19,20. Далее была показана адаптивность этого метода к ряду последующих подходов, таких как флуоресцентная маркировка, местная трансплантация и системная инъекция. Реализация этой процедуры позволит удовлетворить потребность в простом и надежном сборе и применении MSC-EV в трансляционных исследованиях.
Электромобили начинают играть важную роль в различных биологических активностях, включая презентацию антигена, транспорт генетического материала, модификацию микроокружения клеток и другие. Кроме того, их широкое применение открывает новые подходы и возможности для диагностики и ле…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (32000974, 81930025 и 82170988) и Китайского фонда постдокторантуры (2019M663986 и BX20190380). Мы благодарны за помощь Национальному экспериментально-учебно-демонстрационному центру фундаментальной медицины (АМФУ) и Аналитической и испытательной центральной лаборатории Военно-медицинского инновационного центра Медицинского университета ВВС.
10% povidone-iodine (Betadine) | Weizhenyuan | 10053956954292 | Wound disinfection |
Calibration solution | Particle Metrix | 110-0020 | Calibrate the NTA instrument |
Carprofen | Sigma | 53716-49-7 | Analgesic medicine |
Caudal vein imager | KEW Life Science | KW-XXY | Caudal vein imager |
Centrifuge | Eppendorf | 5418R | Centrifugation |
Fatal bovine serum | Corning | 35-081-CV | Culture of UCMSCs |
Formvar/carbon-coated square mesh | PBL Assay Science | 24916-25 | Transmission electron microscope |
Heating pad | Zhongke Life Science | Z8G5JBMz | Post-treatment care of animals |
Heparin Solution | StemCell | 7980 | Systemic injection |
Isoflurane | RWD Life Science | R510-22 | Animal anesthesia |
Minimum Essential Medium Alpha basic (1x) | Gibco | C12571500BT | Culture of UCMSCs |
Nanoparticle tracking analyzer | Particle Metrix | ZetaView PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
PBS (1x) | Meilunbio | MA0015 | Resuspend EVs |
Penicillin/Streptomycin | Procell Life Science | PB180120 | Culture of UCMSCs |
Phosphotungstic acid | Solarbio | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
Pipette | Eppendorf | 3120000224 | |
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma-Aldrich | MINI26 | Labeling EVs |
Skin biopsy punch | Acuderm | 69038-10-50 | Skin defects |
Software ZetaView | Particle Metrix | Version 8.05.14 SP7 | |
Thermostatic equipment | Grant | v-0001-0005 | Water bath |
Transmission electron microscope | HITACHI | HT7800 | Transmission electron microscope |
UCMSCs | Bai'ao | UKK220201 | Commercially UCMSCs |
Ultracentrifuge | Beckman | XPN-100 | Centrifugation |
Ultrapure filtered water purification system | Milli-Q | IQ 7000 | Preparation of ultrapure water |