Isolering, karakterisering och terapeutisk tillämpning av extracellulära vesiklar från odlade humana mesenkymala stamceller
Summary
Detta protokoll beskriver differentialcentrifugeringen för att isolera och karakterisera representativa EV (exosomer och mikrovesiklar) från odlade humana MSC. Ytterligare tillämpningar av dessa elbilar förklaras också i den här artikeln.
Abstract
Extracellulära vesiklar (EV) är heterogena membrannanopartiklar som frigörs av de flesta celltyper, och de erkänns alltmer som fysiologiska regulatorer av organismhomeostas och viktiga indikatorer på patologier; Under tiden växer deras enorma potential att etablera tillgängliga och kontrollerbara sjukdomsterapier fram. Mesenkymala stamceller (MSC) kan frigöra stora mängder EV i odling, vilket har visat sig lovande för att starta effektiv vävnadsregenerering och underlätta omfattande terapeutiska tillämpningar med god skalbarhet och reproducerbarhet. Det finns en växande efterfrågan på enkla och effektiva protokoll för insamling och applicering av MSC-EV. Här tillhandahålls ett detaljerat protokoll baserat på differentiell centrifugering för att isolera och karakterisera representativa EV från odlade humana MSC, exosomer och mikrovesiklar för vidare tillämpningar. Anpassningsförmågan hos denna metod visas för en serie nedströmsmetoder, såsom märkning, lokal transplantation och systemisk injektion. Implementeringen av detta förfarande kommer att tillgodose behovet av enkel och tillförlitlig MSC-EV-insamling och tillämpning i translationell forskning.
Introduction
Stamceller är odifferentierade pluripotenta celler med självförnyelseförmåga och translationell potential1. Mesenkymala stamceller (MSC) isoleras, odlas, expanderas och renas lätt i laboratoriet, vilket förblir karakteristiskt för stamceller efter flera passager. Under de senaste åren har ökande bevis stött uppfattningen att MSC verkar i ett parakrint läge vid terapeutisk användning 2,3. Speciellt utsöndringen av extracellulära vesiklar (EV) spelar en avgörande roll för att förmedla MSC: s biologiska funktioner. Som heterogena membranösa nanopartiklar som frigörs från de flesta celltyper består EV av underkategorier som kallas exosomer (Exos), mikrovesiklar (MV) och ännu större apoptotiska kroppar 4,5. Bland dem är Exos den mest studerade EV med en storlek på 40-150 nm, som är av endosomalt ursprung och aktivt utsöndras under fysiologiska förhållanden. MV bildas genom att kasta direkt från ytan av cellplasmamembranet med en diameter av 100-1000 nm, vilka kännetecknas av högt uttryck av fosfatidylserin och uttryck av ytmarkörer av donatorceller6. EV innehåller RNA, proteiner och andra bioaktiva molekyler, som har liknande funktioner som modercellerna och spelar en viktig roll i cellkommunikation, immunsvar och reparation av vävnadsskador7. MSC-EVs har undersökts allmänt som ett kraftfullt cellfritt terapeutiskt verktyg inom regenerativ medicin8.
Isolering och rening av MSC-härledda elfordon är ett vanligt problem inom forskning och tillämpning. För närvarande är differential- och densitetsgradient ultracentrifugering9, ultrafiltreringsprocess 10, immunomagnetisk separation11, molekylär uteslutningskromatograf 12 och mikrofluidiskt chip13 allmänt använda metoder för isolering och rening av EV. Med fördelarna och nackdelarna med varje tillvägagångssätt kan kvantiteten, renheten och aktiviteten hos insamlade elfordon inte uppfyllas samtidigt14,15. I den aktuella studien visas differentialcentrifugeringsprotokollet för isolering och karakterisering av EV från odlade MSC i detalj, vilket har stött effektiv terapeutisk användning 16,17,18,19,20. Metodens anpassningsförmåga för en rad nedströmsmetoder, såsom fluorescerande märkning, lokal transplantation och systemisk injektion, har vidare exemplifierats. Genomförandet av detta förfarande kommer att tillgodose behovet av enkel och tillförlitlig insamling och tillämpning av MSC-EV i translationell forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
EV växer fram för att spela en viktig roll i olika biologiska aktiviteter, inklusive antigenpresentation, transport av genetiskt material, modifiering av cellmikromiljön och andra. Dessutom medför deras breda tillämpning nya tillvägagångssätt och möjligheter för att diagnostisera och behandla sjukdomar21. Implementering av terapeutiska tillämpningar av EV baseras på framgångsrik isolering och karakterisering. På grund av bristen på standardiserade isolerings- och reningsmetoder och …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av bidrag från National Natural Science Foundation of China (32000974, 81930025 och 82170988) och China Postdoctoral Science Foundation (2019M663986 och BX20190380). Vi är tacksamma för hjälp från National Experimental Teaching Demonstration Center for Basic Medicine (AMFU) och Analytical and Testing Central Laboratory of Military Medical Innovation Center of Air Force Medical University.
Materials
| 10% povidone-iodine (Betadine) | Weizhenyuan | 10053956954292 | Wound disinfection |
| Calibration solution | Particle Metrix | 110-0020 | Calibrate the NTA instrument |
| Carprofen | Sigma | 53716-49-7 | Analgesic medicine |
| Caudal vein imager | KEW Life Science | KW-XXY | Caudal vein imager |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418R | Centrifugation |
| Fatal bovine serum | Corning | 35-081-CV | Culture of UCMSCs |
| Formvar/carbon-coated square mesh | PBL Assay Science | 24916-25 | Transmission electron microscope |
| Heating pad | Zhongke Life Science | Z8G5JBMz | Post-treatment care of animals |
| Heparin Solution | StemCell | 7980 | Systemic injection |
| Isoflurane | RWD Life Science | R510-22 | Animal anesthesia |
| Minimum Essential Medium Alpha basic (1x) | Gibco | C12571500BT | Culture of UCMSCs |
| Nanoparticle tracking analyzer | Particle Metrix | ZetaView PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
| PBS (1x) | Meilunbio | MA0015 | Resuspend EVs |
| Penicillin/Streptomycin | Procell Life Science | PB180120 | Culture of UCMSCs |
| Phosphotungstic acid | Solarbio | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
| Pipette | Eppendorf | 3120000224 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma-Aldrich | MINI26 | Labeling EVs |
| Skin biopsy punch | Acuderm | 69038-10-50 | Skin defects |
| Software ZetaView | Particle Metrix | Version 8.05.14 SP7 | |
| Thermostatic equipment | Grant | v-0001-0005 | Water bath |
| Transmission electron microscope | HITACHI | HT7800 | Transmission electron microscope |
| UCMSCs | Bai'ao | UKK220201 | Commercially UCMSCs |
| Ultracentrifuge | Beckman | XPN-100 | Centrifugation |
| Ultrapure filtered water purification system | Milli-Q | IQ 7000 | Preparation of ultrapure water |
Riferimenti
- Liu, S., et al. The application of MSCs-derived extracellular vesicles in bone disorders: Novel cell-free therapeutic strategy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 619 (2020).
- Arthur, A., Zannettino, A., Gronthos, S. The therapeutic applications of multipotential mesenchymal/stromal stem cells in skeletal tissue repair. Journal of Cellular Physiology. 218 (2), 237-245 (2009).
- Zhou, Y., Yamamoto, Y., Xiao, Z., Ochiya, T. The immunomodulatory functions of mesenchymal stromal/stem cells mediated via paracrine activity. Journal of Clinical Medicine. 8 (7), 1025 (2019).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Mori, M. A., Ludwig, R. G., Garcia-Martin, R., Brandao, B. B., Kahn, C. R. Extracellular miRNAs: From Biomarkers to Mediators of Physiology and Disease. Cell Metabolism. 30 (4), 656-673 (2019).
- Lei, L. M., et al. Exosomes and Obesity-Related Insulin Resistance. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 651996 (2021).
- Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism. Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).
- Gatti, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols In Cell Biology. , 22 (2006).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).
- Zarovni, N., et al. Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches. Methods. 87, 46-58 (2015).
- Boing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Chen, I. H., et al. Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 3175-3180 (2017).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Liu, S., et al. MSC Transplantation Improves Osteopenia via Epigenetic Regulation of Notch Signaling in Lupus. Cell Metabolism. 22 (4), 606-618 (2015).
- Deng, C. L., et al. Photoreceptor protection by mesenchymal stem cell transplantation identifies exosomal MiR-21 as a therapeutic for retinal degeneration. Cell Death and Differentiation. 28 (3), 1041-1061 (2021).
- Wu, M., et al. SHED aggregate exosomes shuttled miR-26a promote angiogenesis in pulp regeneration via TGF-beta/SMAD2/3 signalling. Cell Proliferation. 54 (7), 13074 (2021).
- Qiu, X., et al. Exosomes released from educated mesenchymal stem cells accelerate cutaneous wound healing via promoting angiogenesis. Cell Proliferation. 53 (8), 12830 (2020).
- He, X., et al. MSC-derived exosome promotes M2 polarization and enhances cutaneous wound healing. Stem Cells International. 2019, 7132708 (2019).
- Cheng, L., Hill, A. F. Therapeutically harnessing extracellular vesicles. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (5), 379-399 (2022).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Nielsen, T., et al. Extracellular vesicle-associated procoagulant phospholipid and tissue factor activity in multiple myeloma. PLoS One. 14 (1), 0210835 (2019).
- Zheng, C., et al. Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109 (2021).
- Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).
- Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 9533 (2020).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. Strategies for isolation of exosomes. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6, 36162 (2016).
- Williams, A. M., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes provide neuroprotection and improve long-term neurologic outcomes in a swine model of traumatic brain injury and hemorrhagic shock. Journal of Neurotrauma. 36 (1), 54-60 (2019).
- Li, Z., et al. Apoptotic vesicles activate autophagy in recipient cells to induce angiogenesis and dental pulp regeneration. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 1525 (22), 00304-00305 (2022).
- Nozaki, T., et al. Significance of a multiple biomarkers strategy including endothelial dysfunction to improve risk stratification for cardiovascular events in patients at high risk for coronary heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 54 (7), 601-608 (2009).
- Qi, Y., Ma, J., Li, S., Liu, W. Applicability of adipose-derived mesenchymal stem cells in treatment of patients with type 2 diabetes. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 274 (2019).
- Kumar, A., et al. High-fat diet-induced upregulation of exosomal phosphatidylcholine contributes to insulin resistance. Nature Communications. 12 (1), 213 (2021).
