Ici, nous présentons un protocole pour isoler le mésenchyme intestinal murin, y compris les télocytes. Ceux-ci peuvent être utilisés pour plusieurs applications, telles que la co-culture avec des organoïdes de souris ou d’origine humaine, pour soutenir la croissance et mieux refléter la situation dans le tissu d’origine.
L’intestin grêle murin, ou mésenchyme du côlon, est très hétérogène, contenant des types de cellules distincts, y compris l’endothélium sanguin et lymphatique, les nerfs, les fibroblastes, les myofibroblastes, les cellules musculaires lisses, les cellules immunitaires et le type cellulaire récemment identifié, les télocytes. Les télocytes sont des cellules mésenchymateuses uniques avec de longs processus cytoplasmiques, atteignant une distance de dizaines à des centaines de microns du corps cellulaire. Les télocytes sont récemment apparus comme un composant important de niche des cellules souches intestinales, fournissant des protéines Wnt essentielles à la prolifération des cellules souches et progénitrices.
Bien que des protocoles sur la façon d’isoler le mésenchyme de l’intestin de souris soient disponibles, il n’est pas clair si ces procédures permettent l’isolement efficace des télocytes. L’isolement efficace des télocytes nécessite des ajustements de protocole spéciaux qui permettraient la dissociation du fort contact cellule-cellule entre les télocytes et les cellules voisines sans affecter leur viabilité. Ici, les protocoles d’isolement des mésenchymes intestinaux disponibles ont été ajustés pour soutenir l’isolement et la culture réussis de mésenchymes contenant un rendement relativement élevé de télocytes unicellulaires viables.
La suspension unicellulaire obtenue peut être analysée par plusieurs techniques, telles que l’immunomarquage, le tri cellulaire, l’imagerie et les expériences d’ARNm. Ce protocole produit des mésenchymes avec des propriétés antigéniques et fonctionnelles suffisamment conservées des télocytes, et peut être utilisé pour plusieurs applications. Par exemple, ils peuvent être utilisés pour la co-culture avec des organoïdes dérivés de souris ou d’humains pour soutenir la croissance organoïde sans supplémentation en facteur de croissance, afin de mieux refléter la situation dans le tissu d’origine.
L’intestin grêle et le côlon sont des tissus hautement régénérateurs en raison de la présence de cellules souches, qui prolifèrent et alimentent la régénération1. Le mésenchyme entourant l’épithélium apporte un soutien structurel et fonctionnel en sécrétant des protéines de la matrice extracellulaire et des molécules de signalisation2, qui modulent la réponse des cellules épithéliales. Les télocytes sont de grandes cellules mésenchymateuses, principalement décrites jusqu’à présent par microscopie électronique comme des cellules avec de longs processus cytoplasmiques appelés télopodes, qui se chevauchent pour créer un réseau labyrinthique 3,4,5,6,7. Récemment, les télocytes intestinaux exprimant le facteur de transcription FOXL1 sont apparus comme un composant important de niche des cellules souches fournissant des protéines Wnt, qui sont cruciales pour la fonction des cellules souches et progénitrices. Les télocytes intestinaux expriment des niveaux élevés de protéines clés de la voie de signalisation telles que Wnt, Bmp, Tgfb et Shh, ainsi que de nombreux facteurs de croissance8.
Étant donné que les télocytes sont un composant essentiel de niche des cellules souches di vivo, le développement de protocoles pour les isoler et les cultiver ex vivo permettra leur utilisation comme source de molécules de signalisation et de facteurs de croissance, afin de soutenir la croissance et la différenciation ex vivo. En utilisant des protocoles bien établis, les cryptes épithéliales du côlon ou de l’intestin peuvent être isolées et former des structures 3D connues sous le nom d’organoïdes 9,10,11. Les organoïdes tridimensionnels représentent un outil puissant pour étudier à la fois la physiologie et la pathologie de l’épithélium intestinal ex vivo. Dans un système ex vivo, les organoïdes reposent sur la supplémentation exogène de facteurs pour la survie et la croissance10. Le mésenchyme isolé peut être cultivé avec des organoïdes dérivés de souris et d’humains et utilisé comme source de facteurs de croissance, au lieu d’une supplémentation exogène, pour mieux refléter la situation dans le tissu d’origine. L’étude des télocytes ex vivo présente de nombreux avantages pour étudier plus en détail les comportements cellulaires normaux ou pathologiques, les mécanismes de l’homéostasie tissulaire et les interactions cellule-cellule.
Bien que des protocoles décrivant comment isoler le mésenchyme de l’intestin de souris soient disponibles, il n’est pas clair si ces procédures entraînent l’isolement efficace des télocytes. L’isolement réussi des télocytes nécessite des ajustements de protocole spéciaux qui permettraient la dissociation du fort contact cellule-cellule entre les télocytes et les cellules voisines, sans affecter leur viabilité. Pour surmonter ces limitations, cet article présente un protocole modifié qui produit systématiquement une suspension unicellulaire hautement viable contenant une quantité relativement élevée de télocytes avec des propriétés antigéniques et fonctionnelles suffisamment conservées. Ces télocytes peuvent être utilisés pour plusieurs applications, y compris la co-culture avec des organoïdes dérivés de souris ou d’humains, pour soutenir la croissance sans supplémentation en facteur de croissance. Cela reflète mieux la situation dans le tissu d’origine.
Nous avons utilisé le modèle de souris FOXL1-Cre: Rosa-mTmG modèle 8, dans lequel les télocytes sont marqués avec une version membranaire de la protéine fluorescente verte (GFP) en vert, ce qui permet à l’investigateurde suivre les télocytes dans leur intégralité; Toutes les autres cellules mésenchymateuses sont marquées avec une tdTomate liée à la membrane en rouge. Le protocole actuel a été modifié à partir d’un protocole isolant le mésenchyme intestinal12 afin d’améliorer le rendement et la viabilité des ténocytes.
Ici, nous avons développé un protocole pour isoler le mésenchyme de l’intestin grêle de souris en utilisant le modèle murin FOXL1-Cre: Rosa26-mTmG, qui permet aux chercheurs de distinguer les télocytes des autres cellules mésenchymateuses. Il y a quelques étapes critiques à suivre dans ce protocole. Tout d’abord, il est important de secouer vigoureusement le tube à quatre ou cinq cycles/s, pour éliminer la majorité des cellules épithéliales pendant l’isolement du mésenchyme. Le temps d’incubation pour la digestion enzymatique doit être optimisé en fonction de l’efficacité de la digestion. Pendant l’incubation, les plaques doivent être doucement agitées horizontalement pendant quelques secondes toutes les 20 minutes. Une fois que le tissu devient filamenteux, l’incubation doit être arrêtée en passant à l’étape du protocole 2.12. L’exposition du tissu pendant de longues périodes de digestion peut entraîner un faible taux de viabilité cellulaire et un faible rendement. Après la digestion enzymatique, le tube doit être agité mécaniquement pour libérer plus de cellules individuelles en suspension; Idéalement, la solution devrait avoir l’air trouble et aucun fragment de tissu ne devrait être visible. Si ce n’est pas le cas, prolongez la digestion enzymatique à 60 min.
Maintenir des conditions stériles et éviter une contamination bactérienne potentielle est l’une des étapes critiques lorsque l’on travaille avec une culture tissulaire primaire. Des outils de dissection, des réactifs et des tampons stériles doivent être utilisés; Les gants doivent être changés et la zone de travail doit être nettoyée lorsque le travail avec des animaux est terminé. Une fois la suspension cellulaire obtenue, les travaux doivent être effectués sous une hotte biologique laminaire. Après le placage, les cellules doivent être incubées pendant la nuit sans perturbations, car cela peut affecter l’observance. De plus, il est important de remplacer le milieu de culture un jour après l’ensemencement, car les cellules non adhérentes peuvent affecter la viabilité de la culture.
Les marqueurs de surface utilisés dans ce protocole ont fortement réagi avec leurs épitopes; cependant, il est possible que la digestion enzymatique affecte la réactivité de liaison et, par conséquent, les résultats de l’analyse FACS. Une autre limitation de ce protocole est la sous-représentation de la couche musculaire. Pour améliorer l’efficacité de l’isolation cellulaire de la couche musculaire, nous recommandons la séparation mécanique du muscle des couches muqueuses et la digestion enzymatique séparée pour chacune des couches. Pour dissocier l’épithélium du stroma, une séparation mécanique ou des agents chélatants (EDTA ou DTT) peuvent être utilisés; Cependant, la digestion enzymatique pour obtenir des cellules uniques a été optimisée dans ce protocole.
L’isolement du mésenchyme intestinal a déjà été décrit8 ; gratter les villosités avec une lamelle de couverture entraînerait la perte d’une partie du mésenchyme le long des villosités, en particulier des cellules mésenchymateuses de l’extrémité des villosités telles que les télocytes de l’extrémité des villosités Lgr5+ 13. Dans ce protocole, nous utilisons la collagénase de type VIII au lieu de la dispase II et de la trypsine en combinaison avec la DNase I, car la collagénase libère plus efficacement les cellules mésenchymateuses de la matrice. Bien qu’il prolonge le temps de traitement (>90 min contre 35 min), les deux protocoles ont donné des taux de viabilité cellulaire similaires; Le protocole actuel a amélioré le rendement des cellules mésenchymateuses en général, et plus particulièrement de la fraction téloucytaire. Le protocole actuel a produit environ 10% de télocytes GFP+, confirmés à la fois par visualisation et par analyse FACS, tandis que le protocole précédent a produit 2% de télocytes GFP+. Les principales différences entre le protocole actuel et les deux protocoles de référence sont énumérées dans le tableau supplémentaire S1.
L’identification des cellules FOXL1+GFP+ en tant que télocytes sous-épithéliaux est basée sur des études in vivo . La nécessité de développer et de modifier les protocoles d’isolement des mésenchymes disponibles pour produire des rendements plus élevés de télocytes, et la connaissance de la façon d’y parvenir était basée sur notre compréhension de la structure et de la fonction des télocytes FOXL1+ in vivo, en tant que grandes cellules avec de longues projections cellulaires étroitement attachées aux cellules épithéliales.
Fait intéressant, les télocytes GFP+ ex vivo présentent des caractéristiques cellulaires similaires à leurs caractéristiques in vivo dans l’intestin et sont donc suggérés pour servir de support idéal pour la croissance organoïde. Bien que ce protocole traite principalement de l’isolement des ténocytes de l’intestin grêle, un protocole similaire avec des modifications mineures peut être utilisé et facilement appliqué pour les cellules mésenchymateuses du côlon, telles que les cellules stromales intestinales régulées MAP3K2 (MRISC) récemment décrites récemment.
Une fois que les cellules mésenchymateuses se sont étirées et ont atteint la confluence, elles peuvent être utilisées pour plusieurs applications supplémentaires, telles que la co-culture 3D avec des organoïdes dérivés de souris ou d’humains, en utilisant Matrigel sans facteur de croissance. Le mésenchyme forme généralement un réseau soutenant pleinement la formation et la croissance organoïdes sans supplémentation en facteur de croissance exogène. Le stroma intestinal a des caractéristiques 3D intrinsèques qui peuvent fournir à l’épithélium un soutien mécanique14. Par conséquent, ce protocole peut également être utilisé pour isoler le mésenchyme à intégrer dans un échafaudage bio-imprimé 3D et utilisé pour d’autres expériences de xénogreffe.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation israélienne des sciences (subvention personnelle MSC) et le programme conjoint entre la Fondation israélienne des sciences et la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine.
15 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430052 | |
50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430828 | |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
6 Well Cell Culture Plate | Costar | 3516 | |
APC Anti-Mouse CD31 | Biolegend | 102509 | |
APC Anti-Mouse CD326 | Biolegend | 118213 | |
APC Anti-Mouse CD45 | Biolegend | 103111 | |
Cell Lifter | Corning | 3008 | |
Cell Strainer 100μm Nylon Yellow | Corning | CLS431752 | |
Collagenase type VIII | Sigma | C2139-500MG | |
DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815-1G | |
DMEM/F-12 (HAM) 1:1 | Biological Industries | 01-170-1A | |
DNase I | Sigma | DN25-1G | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Biological Industries | 01-055-1A | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D1283-500ML | 10x |
EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Biological Industries | 01-862-1B | |
FBS | Biological Industries | 04-007-1A | |
Gentamicin | Sigma | G1914-250MG | 100x |
Gluta Max-I | Gibco | 35050-038 | 100x |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Biological Industries | 02-017-5A | 10x |
HEPES | Gibco | 15630-080 | 100x |
Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep) | Biological Industries | 03-033-1B | 100x |
RPMI 1640 medium | Gibco | 21875-034 | |
Trypsin EDTA Solution B | Sartorius | 03-052-1A |