Summary
שיטת הכנת דגימות חדשנית מודגמת לניתוח של מקרוקולוניות חיידקים מבוססות אגר באמצעות ספקטרומטריית מסה של הדמיית ספיחה / יינון בלייזר בסיוע מטריצה.
Abstract
הבנת ההשלכות המטבוליות של אינטראקציות מיקרוביאליות המתרחשות במהלך זיהום מציבה אתגר ייחודי לתחום הדימות הביו-רפואי. ספקטרומטריית מסות הדמיה בסיוע לייזר בסיוע מטריצה (MALDI) מייצגת שיטת הדמיה באתרה נטולת תוויות המסוגלת ליצור מפות מרחביות עבור מגוון רחב של מטבוליטים. בעוד שדגימות רקמה בחתך דק מנותחות כיום באופן שגרתי באמצעות טכנולוגיה זו, ניתוחי ספקטרומטריית מסות הדמיה של מצעים לא מסורתיים, כגון מושבות חיידקים הגדלות בדרך כלל על אגר במחקר מיקרוביולוגי, נותרו מאתגרים בשל תכולת המים הגבוהה והטופוגרפיה הלא אחידה של דגימות אלה. מאמר זה מדגים זרימת עבודה להכנת דגימות כדי לאפשר ניתוח ספקטרומטריית מסות הדמיה של סוגי דגימות אלה. תהליך זה מודגם באמצעות מושבות מקרו-מושבות של תרבית חיידקית משותפת של שני פתוגנים במערכת העיכול: Clostridioides difficile ו- Enterococcus faecalis. חקר אינטראקציות מיקרוביאליות בסביבת אגר מוגדרת היטב זו הוכח גם כמשלים מחקרי רקמות שמטרתם להבין שיתוף פעולה מטבולי מיקרוביאלי בין שני אורגניזמים פתוגניים אלה במודלים של זיהום בעכברים. ניתוחי ספקטרומטריית מסה של המטבוליטים של חומצות האמינו ארגינין ואורניתין מוצגים כנתונים מייצגים. שיטה זו ישימה באופן נרחב לאנליטים אחרים, פתוגנים מיקרוביאליים או מחלות, וסוגי רקמות שבהם נדרשת מידה מרחבית של ביוכימיה תאית או רקמתית.
Introduction
המיקרוביום האנושי הוא מערכת אקולוגית דינמית ביותר הכוללת אינטראקציות מולקולריות של חיידקים, נגיפים, ארכאה ואיקריוטים מיקרוביאליים אחרים. בעוד שיחסים מיקרוביאליים נחקרו באינטנסיביות בשנים האחרונות, עדיין ניתן להבין הרבה על תהליכים מיקרוביאליים ברמה הכימית 1,2. זה נובע בחלקו מחוסר הזמינות של כלים המסוגלים למדוד במדויק סביבות מיקרוביאליות מורכבות. ההתקדמות בתחום ספקטרומטריית מסות הדמיה (IMS) בעשור האחרון אפשרה מיפוי מרחבי באתרו וללא תוויות של מטבוליטים, שומנים וחלבונים רבים במצעים ביולוגיים 3,4. ספיחה/יינון לייזר בסיוע מטריצה (MALDI) התפתחה כטכניקת היינון הנפוצה ביותר המשמשת בספקטרומטריית מסות הדמיה, הכוללת שימוש בלייזר UV כדי לעבד חומר מפני השטח של קטע רקמה דק למדידה על ידי ספקטרומטריית מסה4. תהליך זה מתאפשר על ידי יישום מטריצה כימית המיושמת באופן הומוגני על פני השטח של הדגימה, ומאפשרת לבצע מדידות רציפות בתבנית רסטר על פני שטח הדגימה. מפות חום של עוצמות יונים אנליטיות נוצרות לאחר מכן לאחר איסוף נתונים. ההתקדמות האחרונה במקורות יינון וטכניקות דגימה אפשרה ניתוח של מצעים לא מסורתיים כגון חיידקים5 ויונקים 6,7,8 דגימות תאיות שגדלו על אגר מזין. המידע המולקולרי המרחבי המסופק על ידי IMS יכול לספק תובנה ייחודית לגבי התקשורת הביוכימית של אינטראקציות מיקרוב-מיקרוב ומיקרובים מארחים במהלך זיהום 9,10,11,12,13,14.
עם זיהום Clostridioides difficile (CDI), C. difficile נחשף לסביבה מיקרוביאלית המשתנה במהירות במערכת העיכול, שבה אינטראקציות מיקרוביאליות צפויות להשפיע על תוצאות זיהום15,16. באופן מפתיע, מעט ידוע על המנגנונים המולקולריים של אינטראקציות בין C. difficile לבין מיקרוביוטה תושב במהלך זיהום. לדוגמה, אנטרוקוקים הם קבוצה של פתוגנים אופורטוניסטיים במיקרוביום המעי ונקשרו לרגישות מוגברת ולחומרה של CDI17,18,19,20. עם זאת, מעט ידוע על המנגנונים המולקולריים של האינטראקציות בין פתוגנים אלה. כדי להמחיש תקשורת של מולקולות קטנות בין החברים האלה במיקרוביום המעי, מקרו-מושבות חיידקים גודלו כאן על אגר כדי לדמות אינטראקציות מיקרואורגניזם והיווצרות ביופילם חיידקי בסביבה מבוקרת. עם זאת, השגת התפלגות מטבולית מייצגת בניתוח ספקטרומטריית מסה של הדמיית MALDI של דגימות תרבית חיידקים היא מאתגרת בשל תכולת המים הגבוהה וטופוגרפיית פני השטח הלא אחידה של דגימות אלה. זה נגרם בעיקר על ידי האופי ההידרופילי מאוד של אגר ואת התגובה משטח אגר לא אחיד במהלך הסרת לחות.
תכולת המים הגבוהה של אגר יכולה גם להקשות על השגת ציפוי מטריצת MALDI הומוגני ויכולה להפריע לניתוח MALDI הבא שבוצע ב- vacuo21. לדוגמה, מקורות MALDI רבים פועלים בלחצים של 0.1-10 Torr, שהוא ואקום מספיק כדי להסיר לחות מהאגר ויכול לגרום לעיוות של הדגימה. שינויים מורפולוגיים אלה באגר הנגרמים על ידי סביבת הוואקום גורמים לבעבוע וסדקים בחומר האגר המיובש. ממצאים אלה מפחיתים את ההיצמדות של האגר למגלשה ויכולים לגרום לפירוק או התקלפות של הדגימה לתוך מערכת ואקום המכשיר. עובי דגימות האגר יכול להיות עד 5 מ"מ מהמגלשה, מה שעלול ליצור מרווח לא מספיק מאופטיקת היונים בתוך המכשיר, ולגרום לזיהום ו/או נזק לאופטיקה של יונים במכשיר. השפעות מצטברות אלה יכולות לגרום להפחתה של אות היונים המשקף את טופוגרפיית פני השטח, במקום את האינטראקציות הביוכימיות המיקרוביאליות הבסיסיות. דגימות אגר חייבות להיות מיובשות בצורה הומוגנית ולהיות מודבקות בחוזקה לשקופית מיקרוסקופ לפני ניתוח בחלל ריק.
מאמר זה מדגים תהליך הכנה לדוגמה לייבוש מבוקר של מושבות מאקרו בתרבית חיידקים הגדלות על מצע אגר. תהליך ייבוש רב שלבי ואיטי זה (יחסית לאלה שדווחו בעבר) מבטיח כי האגר יתייבש באופן אחיד תוך מזעור ההשפעות של בעבוע או פיצוח של דגימות אגר המותקנות על שקופיות מיקרוסקופ. על ידי שימוש בשיטת ייבוש הדרגתית זו, הדגימות נצמדות מאוד לשקופית המיקרוסקופ וניתנות ליישום מטריצה עוקב ולניתוח MALDI. הדבר מודגם באמצעות מושבות חיידקים מודל של C. difficile הגדלות על מודלים של רקמת אגר ומורין המכילות CDI עם וללא נוכחות של פתוגן קומנסלי ואופורטוניסטי, Enterococcus faecalis. ניתוח ספקטרומטריית מסה של MALDI של מודלים חיידקיים ורקמתיים מאפשר מיפוי מרחבי של פרופילי מטבוליטים של חומצות אמינו, ומספק תובנה חדשה לגבי מטבוליזם מיקרוביאלי ביו-אנרגטי ותקשורת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדות הטיפול והשימוש בבעלי חיים של בית החולים לילדים בפילדלפיה ובית הספר לרפואה פרלמן באוניברסיטת פנסילבניה (פרוטוקולים IAC 18-001316 ו- 806279).
זהירות: Clostridium difficile (C. difficile) ו - Enterococcus faecalis (E. faecalis) הם פתוגנים BSLII ויש לטפל בהם בזהירות רבה. השתמש בפרוטוקולי טיהור מתאימים בעת הצורך.
1. גידול מושבות מאקרו של תרביות חיידקים והכנה למשלוח בן לילה
- הכינו תרביות לילה של C. difficile ו-E. faecalis וגדלו אותן בנפרד בטמפרטורה של 37°C בתא אנאירובי (85% חנקן, 10% מימן, 5% פחמן דו-חמצני) בציר עירוי מוח-לב בתוספת תמצית שמרים 0.5% ו-0.1% L-ציסטאין (BHIS). יש להשתמש באגר 1.5% עבור כל הדגימות המצופות.
- נרמלו את מדיית תרבית החיידקים לצפיפות אופטית של 600 ננומטר (OD600). צלחת 5 μL של כל macrocolony על BHIS + L-ציסטאין צלחות אגר ולגדול אנאירובית במשך 7 ימים ב 37 ° C. עבור מקרו-מושבות של מינים מעורבים, ערבבו את תרבית החיידקים ביחס של 1:1 לפני הציפוי.
- הכינו שקופיות מיקרוסקופ מצופות תחמוצת בדיל אינדיום (ITO) באמצעות אומטר כדי לזהות את צד השקופית עם הציפוי המוליך. השתמש בסופר משובץ יהלומים כדי לחרוט ולתייג את הצד המצופה ITO של שקופית המיקרוסקופ.
- הוציאו את כל התרבית מצלחת הגידול של האגר ולאחר מכן הרכיבו אותה על מגלשת מיקרוסקופ מצופה ITO תוך הבטחה שבועות אוויר אינן כלואות בין האגר למגלשה.
הערה: תכולת המים במצע האגר צריכה לאפשר לתרבית להיצמד באופן טבעי למשטח המגלשה במיקרוסקופ. סרטון המדגים תהליך זה מובא בתיעוד המשלים של Yang et al.22. - מקמו את המושבות בקופסאות שקופיות במיקרוסקופ להגנה. אחסן את קופסאות השקופיות בגודל 8 אינץ' x 8 בשקיות הובלת דגימות מסוכנות ביולוגית עם חופן כדורי ייבוש ואטם למשלוח בן לילה להמשך עיבוד וניתוח.
הערה: חשוב לשמור על סביבה יבשה עבור תרביות החיידקים כאשר הם נשלחים בתנאי סביבה כדי להאט את צמיחת החיידקים ואת חילוף החומרים ולשמור על קיבוע של דגימות החיידקים עד לניתוח. שיטת משלוח זו עברה אופטימיזציה באמצעות ניסויים נרחבים והיא עדיפה על פני משלוח המושבות הקפואות בקרח יבש. שינויי טמפרטורה משמעותיים לפני הייבוש נוטים לגרום לפירוק ולבעבוע מתחת לדגימת האגר הרכובה.
2. ייבוש סביבתי של C. difficile + E. faecalis חיידקי macrocolonies
- הסר את מושבות חיידקי האגרוז המותקנות על שקופיות מיקרוסקופ מצופות ITO מחומר האריזה. מניחים את הדגימות בקופסה יבשה עם חומר ייבוש למשך 48-72 שעות בטמפרטורת החדר.
הערה: זהו תהליך ייבוש עדין ואיטי הממזער בעבוע, סדיקה או ניתוק של מדיית האגר משטח השקופיות של המיקרוסקופ. - יש להשליך כראוי את כל חומרי האריזה המזוהמים ולטהר את סביבת העבודה בחומר חיטוי מתאים.
- בדוק חזותית את המושבות עבור עיוותים במשטח אגר (למשל, מבעבע, סדק, פורק).
הערה: גובה משטח האגרוז אמור לרדת באופן ניכר לעין ולשכב שטוח על פני המגלשה.
3. ואקום וייבוש בתיווך חום של C. difficile + E. faecalis חיידקי macrocolonies
הערה: נבנה מתקן ייבוש ואקום מותאם אישית (איור 1) כדי להקל על הסרת לחות עודפת מדגימות האגר. מכשיר זה משתמש במשאבת ואקום סיבובית המחוברת בקו לביו-פילטר HEPA, מלכודת קור ותא נירוסטה, שבו ממוקמות דגימות החיידקים. שנאי מתח משתנה מחובר לחוט נימה מבודד, המאפשר למשתמש לחמם את התא כדי לזרז את תהליך הייבוש.
- סגור את קו הוואקום לתא הדגימה והפעל את מתג ההפעלה למשאבת השדרה הסיבובית כדי לאפשר למשאבת הוואקום להתחמם ולהשיג לחץ ואקום תקין.
- הפעל את שנאי המתח המשתנה כדי לחמם את חוט הלהט הכרוך סביב התא. התאם את ספק הכוח המשתנה עד שהטמפרטורה הפנימית של תא הוואקום תגיע ~ 50 ° C. בזמן שהמשאבה מתחממת, הכניסו תרחיף של קרח יבש ו-100% אתנול לתוך המעבה של מלכודת הקור.
הערה: מלכודת הקור מעבה אדים או נבגים מהדגימה ומונעת זיהום של מערכת משאבת השדרה הסיבובית ושמן משאבת הוואקום. - פתח את תא הוואקום באמצעות מפתח ברגים כדי לשחרר את מהדקי האוגן הכפולים בקוטר 16 מ"מ. הכניסו את דגימות האגרוז לתא ואטמו את התא בחוזקה עם מהדקי אוגן טופר כפולים בקוטר 16 מ"מ.
- פתח את שסתום המשאבה כדי לפנות את החדר. הניחו לדגימות להתייבש במשך 60-120 דקות (למשל, ב~150 mTorr).
הערה: זמן ייבוש זה מספיק כדי להסיר את רוב הלחות בחלקי אגר קטנים. קביעה אמפירית של זמן הייבוש האופטימלי להסרת לחות והקטנת גובה האגר עשויה להיות נחוצה בהתאם להגדרה האישית ולדגימות. זמני ייבוש ארוכים משמעותית עלולים לגרום לאגר המיובש להיות שביר ונוטה להיסדק. - בסיום, אווררו באיטיות את תא הוואקום ללחץ הסביבה על ידי סגירת השסתום במשאבת השדרה הסיבובית ופתיחת השסתום החיצוני לאוויר הסביבה. פתח את התא באמצעות הפרוטוקול שהוזכר לעיל והסר את דגימת האגרוז המיובשת מהחדר.
- יש לאחסן את הדגימה בקופסה יבשה עם חומר ייבוש עד ליישום המטריצה.
הערה: איור 2 מציג תמונות של משטח האגר לפני ואחרי הייבוש.
4. יישום מטריצה MALDI באמצעות ריסוס רובוטי
הערה: לאחר שדגימות האגרוז יובשו היטב וגובה קטעי התרבית ירד במידה ניכרת, השתמש במרסס מטריצה רובוטי כדי להחיל באופן הומוגני ציפוי דק של תרכובת מטריצה כימית MALDI. הליך זה צריך להתבצע במכסה אדים כימי ועם ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות, משקפי מעבדה ומעיל מעבדה.
- בחר את מטריצת MALDI המתאימה. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, השתמש במטריצת MALDI 1,5-diaminonaphthalene (DAN) עבור ספיחה חיובית שלה ויינון של חומצות אמינו במצב יונים שליליים.
- הכינו 10 מ"ל של תמיסת מטריצה של 10 מ"ג/מ"ל דן מאלדי ב-90/10 (v/v) אצטוניטריל/מים. השתמש בממיסים באיכות HPLC, בצע סוניזציה למשך 30 דקות וסנן את התמיסה דרך מסנני מזרק ניילון 0.2 מיקרומטר לפני הכניסה למשאבת מזרק הריסוס הרובוטית. בנוסף, הכינו תמיסות כביסה כדי להבטיח שקו הריסוס נקי בין כל שימוש.
הערה: תמיסות שטיפה נבחרות כדי להגביר את מסיסות המטריצה ומזהמים אחרים בקו הריסוס ולהקל על הוצאתם מהמערכת. תמיסות השטיפה המשמשות כאן הן 90/10 (v/v) אצטוניטריל/מים, 50/50 (v/v) מים/מתנול, 99/1 (v/v) אצטוניטריל/חומצה אצטית, ו-95/5 (v/v) מים/אמוניום הידרוקסיד. - חברו את הדגימה למגש הריסוס והעמיסו את התמיסות המוכנות לקו הריסוס (איור 3). באמצעות תוכנת המחשב, ציין את הפרמטרים הדרושים כדי לאפשר ציפוי אחיד של תרכובת המטריצה: טמפרטורת זרבובית 30 °C, שמונה מעברים, קצב זרימה של 0.1 מ"ל / דקה, תבנית CC, זמן ייבוש של 0 שניות, 10 psi.
הערה: מקובל שרוב הפתוגנים יושבתו על ידי יישום של מטריצת MALDI, שהיא בדרך כלל חומצה אורגנית קטנה או בסיס. - לאחר סיום רצף הריסוס, מוציאים את הדגימה ממגש הריסוס ומאחסנים בארון ייבוש עד לניתוח.
5. הכנת מקרוקולוניות חיידקים לרכישת נתונים בספקטרומטריית מסות של הדמיית MALDI
הערה: כל ניתוחי ספקטרומטריית המסות של הדימות בוצעו באמצעות ספקטרומטר מסות FTICR (Port transform ion cyclotron resonance). מכשיר זה מצויד במערכת לייזר Nd:YAG MALDI (2 קילוהרץ, 355 ננומטר).
- הכנס את הדגימה המצופה מטריצה למתאם השקופיות של מיקרוסקופ צלחת המטרה MALDI ורשום לפחות שלושה סמנים פידוקיאליים המקיפים את אזור הדגימה באמצעות סמנים קבועים (איור 4). השתמש בסורק שטוח כדי לקבל תמונה אופטית של שקופית המיקרוסקופ כולל הסמנים הפידוקיאליים.
הערה: הסמנים הפידוקיאליים יאפשרו את רישום התמונה האופטית לתצוגת המצלמה MALDI שנצפתה במכשיר. - הגדר שיטת מכשיר MS הממוטבת לטווח המסות, הרגישות והרזולוציה הרצויים, הכוללת כיול מסה, הגדרות לייזר MALDI, פרמטרים של אופטיקת יונים ותנאי תאי ICR. בשיטה זו, בחר חלון מסה של 100 Da מ- m/z 100 עד 200 להעשרת אות פאזת גז במצב יון שלילי באמצעות גישת הצטברות רציפה של יונים נבחרים (CASI),23 המקיפה את ערכי m/z של המטבוליטים המעניינים.
- פתח את תוכנת רכישת התמונה של המכשיר והשתמש באשף ההתקנה כדי להגדיר את שם הקובץ והמיקום, את שיטת רכישת MS, אזורים מעניינים לדגימה, ואת הרזולוציה המרחבית של התמונה.
הערה: רזולוציות מרחביות של 100-300 מיקרומטר משמשות בדרך כלל להדמיית מקרוקולוני חיידקים. - לאחר שכל הפרמטרים הוגדרו, התחל את רצף הרכישה כדי לרכוש באופן סדרתי ספקטרום מסה בכל פיקסל על פני האזורים המוגדרים של עניין.
הערה: זמן רכישת התמונה תלוי בהגדרות המכשיר, אך בדרך כלל נע בין 2 ל-6 שעות בתמונות המכילות 5,000-10,000 פיקסלים.
6. הדמיה, ספקטרומטריית מסות, ניתוח נתונים וזיהוי תרכובות;
- לאחר רכישת תמונה, שמור את הנתונים עם סיומת הקובץ ".mis", שהיא תבנית קובץ ספציפית לספק עבור פלטפורמות ספקטרומטריית מסות הדמיה. פתח את קובץ הנתונים בחבילות תוכנה flexImaging או SCiLS או יצא לתבנית נתונים שאינה קניינית, כגון .mzml, והצג באופן חזותי באמצעות תוכנה ניטרלית של הספק (לדוגמה, Cardinal24 או MSIreader25,26).
הערה: ספקטרום מסה ממוצע מוצג בעת פתיחת נתוני ההדמיה ב- flexImaging, המייצג את העוצמות הממוצעות של כל היונים שזוהו באזורים שנדגמו. ניתן לזהות פסגות עניין באופן טנטטיבי על סמך מדידות מסה מדויקות. בדרך כלל, דיוקי מסה של יותר מ -5 חלקים למיליון (ppm) מספיקים לזיהוי מטבוליטים בספקטרומטרים של מסות FTICR. - באמצעות התוכנה המוזכרת, הגדר חלונות מסה עבור פסגות עניין כדי ליצור מפות חום בצבע כוזב של התפלגות יונים על פני האזורים שנדגמו.
- בתצוגת ספקטרום המסה הממוצעת , התקרבו לשיא העניין ובחרו חלון מסה מתאים המקיף את האזור של פרופיל הפסגה.
- לחץ לחיצה ימנית על חלון המסה המסומן ובחר הוסף מסנן מסה.... תייג את ערך m/z שנבחר באמצעות זיהוי טנטטיבי עבור המטבוליט החשוד כפי שנקבע על ידי מדידת המסה המדויקת ברזולוציה גבוהה.
- בחרו בסף העוצמה כדי להתאים את הטווח הדינמי של התמונה האנליטית המוצגת במפת החום בצבע כוזב. התאימו עוד יותר את פרמטרי סינון המסה כך שחלון המסה יקיף את האזור של פרופיל הפסגה, ולאחר מכן הוסיפו את מסנן המסה.
הערה: ניתן לבצע נורמליזציה של עוצמה בהתאם לצורך כדי לשפר את הכימות היחסי בין האזורים הנמדדים. הניסויים כאן השתמשו ברכישת נתוני CASI (vide infra), שעלולה להפוך את שיטות הנורמליזציה של ספירת היונים הכוללת (TIC) וריבוע ממוצע השורש (RMS) ללא מדויקות. לפיכך, כל תמונות היונים המוצגות כאן מוצגות ללא נורמליזציה.
7. הכנה ומשלוח של בקרה לא נגועה ורקמות CECAL נגועות בעכבר C. difficile
- יש לטבול עכברים זכרים C57BL/6 בני 4-8 שבועות עם אנטיביוטיקה (0.5 מ"ג / מ"ל cefoperazone או 0.5 מ"ג / מ"ל cefoperazone + 1 מ"ג / מ"ל vancomycin) במי שתייה ad libitum במשך 5 ימים, ולאחר מכן תקופת החלמה של יומיים וזיהום לאחר מכן.
- הרדימו את בעלי החיים על ידי חנקCO2 וקצרו את איבר הצקום של העכבר באופן מיידי. יש להטמיע בתערובת של 20% של תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) במים מזוקקים.
- מניחים את הדגימות על קרח יבש ולאחר מכן לארוז ולשלוח לניתוח; יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C עד לניתוח.
8. Cryosectioning של בקרת לא נגוע verus C. difficile -נגוע עכבר רקמות cecal נגוע
- נקה את כל ציוד ההקפאה על ידי שטיפה עם 100% אתנול ואפשר להתייבש לפני הכנסת הדגימות לתא ההקפאה. הכן שקופיות מיקרוסקופ מצופות ITO באמצעות אומטר כדי לזהות את הצד של השקופית עם הציפוי המוליך. השתמש בסופר משובץ יהלומים כדי לחרוט ולתייג את הצד המצופה ITO של שקופית המיקרוסקופ.
הערה: יש ללבוש ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות, משקפי מעבדה, מעיל מעבדה ושרוולי הקפאה. - בצע cryosectioning על cryomicrotome מחקר. העבר את רקמות ceca העכבר המוטבעות OCT ממקפיא -80 ° C לתא cryomicrotome (טמפרטורת תא 30 ° C, -28 ° טמפרטורת אובייקט צלזיוס) על קרח יבש. הרכיבו את דגימות הרקמה להשוואה באמצעות ספקטרומטריית מסות הדמיה (למשל, בקרה לא נגועה לעומת C. difficile-infected) על אותה שקופית מיקרוסקופ כדי להבטיח הכנת דגימה זהה של שני סוגי הרקמה ולאפשר השוואות מטבוליטים מדויקות.
- בתוך תא הקריומיקרוטום, הרכיבו את הרקמה המוטבעת ב-OCT על צ'אק דגימה באמצעות תמיסת OCT נוספת. לאחר שתמיסת OCT התמצקה, קבע את הצ'אק לראש הדגימה. התחל בהקפאה במרווחים של 10-50 מיקרומטר כדי להגיע לעומק/מישור הרקמה הרצוי של האיבר.
- לאחר שמגיעים לחתך אופטימלי של הרקמה, מתחילים לאסוף חתכים בעובי 12 מיקרומטר. טפלו בעדינות את הפרוסה בעזרת מברשות צבע אמנותיות והניחו אותה על שקופית מיקרוסקופ מצופה טפלון.
- גלגלו את שקופית המיקרוסקופ המצופה ITO על גבי מקטע הרקמה כדי להרים את הרקמה מהמגלשה המצופה טפלון. הפשרה הרכיבו את מקטע הרקמה על מגלשת המיקרוסקופ על ידי לחיצה על כף היד לחלק האחורי של המגלשה המצופה ITO. ממשיכים להפשיר עד שמקטע הרקמה הופך משקוף למרקם אטום/מט.
- העבירו את שקופיות המיקרוסקופ המורכב על רקמות על קרח יבש לקופסה יבשה עם חומר מייבש לאחסון לניתוח באותו יום, או אחסנו בטמפרטורה של -80°C לאחסון לטווח ארוך יותר.
9. הכנת בקרה לא נגועה לעומת C. difficile -נגוע רקמות cecal עכבר נגוע עבור יישום מטריצה ו MALDI הדמיה ספקטרומטריית מסה
- בצע יישום מטריצה MALDI באמצעות אותו פרוטוקול המתואר בשלב 4 (טמפרטורת זרבובית 30 ° C, שמונה מעברים, קצב זרימה של 0.1 מ"ל / דקה, תבנית CC, זמן ייבוש של 0 שניות, 10 psi).
- בצע ספקטרומטריית מסה של דימות MALDI באמצעות אותם פרוטוקולים המתוארים בשלבים 5 ו- 6.
- נתחו את תמונות היונים משכפלים ביולוגיים מרובים והשוו את התוצאות לקבלת מובהקות באמצעות השוואות תרשים של קופסאות עוצמה באמצעות התוכנה הסטטיסטית SCiLS שהוזכרה לעיל.
הערה: המבחנים וההשוואות הסטטיסטיים המתאימים יהיו תלויים ביישום ויכולים לכלול פילוח מרחבי, מודלים לסיווג וניתוח השוואתי לקביעת תכונות ספקטרליות מפלות ומתואמות. ניתוחים השוואתיים יכולים לכלול הקצאת ערכי p לתכונות משמעותיות, יצירת ניתוחי רכיבים עיקריים להשוואות רקמות והצגה חזותית של תרשימי תיבות כדי לזהות וריאציות. כדאי גם לדמיין את הרקמה באמצעות מיקרוסקופ brightfield של קטע הרקמה המוכתם באמצעות hematoxylin ו eosin (H&E) לאחר ספקטרומטריית מסה הדמיה. הדבר מאפשר זיהוי ברור של תכונות מורפולוגיות ברקמה וניתן לנתח אותו בהתייעצות עם פתולוג מיומן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ביצענו ספקטרומטריית מסה של הדמיית MALDI מטבוליט של מושבות חיידקי מודל ועכברים שעברו קולוניזציה משותפת עם E. faecalis ו-C. difficile כדי לחקור את תפקידן של חומצות אמינו באינטראקציות מיקרואורגניזם-מיקרובים. מקרומושבות חיידקים הגדלות על אגר משמשות כמודל מוגדר היטב לניתוח שינויים ביוכימיים מובהקים בהיווצרות ביופילם חיידקי. חשוב להקפיד על תהליך ייבוש מבוקר של מושבות מאקרו בתרבית חיידקים הגדלות על מצע אגר כדי למזער עיוותים וסדקים במשטח האגר. זה הושג באמצעות תהליך דו-שלבי, הכולל ייבוש ראשוני עם חומר ייבוש תחת טמפרטורת הסביבה והלחץ, ואחריו שלב ייבוש מהיר יותר בסיוע ואקום שבוצע בטמפרטורה גבוהה. נעשה שימוש במכשיר ייבוש שנבנה במיוחד כדי להקל על התייבשות אגר תוך לכידת שחרור מזהמים חיידקיים או נבגים מהדגימות (איור 1). שלב הייבוש הנוסף בוואקום נחוץ כדי להבטיח שהדגימות יתייבשו לחלוטין ולא יעברו עיוות עם החשיפה לוואקום הטרשת הנפוצה.
מקטעי אגר היו בתחילה בגובה דגימה של 2-4 מ"מ (איור 2A) והופחתו לגובה ~0.5 מ"מ בעקבות פרוטוקול הייבוש (איור 2B). חשוב להקפיד על ייבוש אחיד על פני משטח הדגימה במהלך פרוטוקול הכנת הדגימה. שינויים גדולים בגובה הדגימה יגרמו לקרן לייזר MALDI לא ממוקדת על פני הדגימה, מה שעלול להשפיע לרעה על יעילות היינון וכתוצאה מכך על עוצמת היונים האנליטיים. דוגמה לתהליך ייבוש לא מוצלח מוצגת באיור 2D, שבו משטח האגר בעבע ונסדק, מה שהופך את הדגימה לבלתי שמישה לניתוח נוסף. לאחר שדגימת החיידק יובשה היטב, שכבת מטריצה של DAN MALDI מיושמת באמצעות מרסס רובוטי (איור 3). מכשיר זה מאפשר בקרה מדויקת של פרמטרי הריסוס, ומאפשר יישום של ציפוי מטריצה אחיד (איור 2C).
לאחר יישום המטריצה, שקופיות המיקרוסקופ המכילות את הדגימות מוכנסות למתאם שקופיות לניתוח על FTICR MS (איור 4). הקואורדינטות בשקופית נרשמות בין תוכנת רכישת ספקטרומטריית המסות של ההדמיה לבין מצלמת המכשיר על-ידי ציור סימנים ראשוניים על השקף סביב האזורים שיימדדו (מסומנים בסמלי "+" באיור 4). לאחר מכן השקופית נסרקת דיגיטלית באמצעות סורק שטוח כדי להקליט תמונה אופטית, המשמשת לאחר מכן להגדרת רצף הרכישה בתוכנת flexImaging. ביצענו אופטימיזציה של הגדרות מכשיר ספקטרומטריית המסות לשידור וזיהוי של אניונים מטבוליטים. באמצעות העשרת יונים בפאזה גזית CASI, הוגדר חלון בידוד יונים לצבירה סלקטיבית של יונים ב-m/z 150 ±-50 Da (איור 5A), המכיל מערך של תרכובות שנצפו מפני השטח של הרקמה. באופן ספציפי כאן עבור זיהום C. difficile, מצאנו מסלולים חומצות אמינו כדי להדגים תפקידים מעניינים ומשתנים במהלך קטבוליזם חיידקי. בהתבסס על מדידות מסה מדויקות, אותות היונים זוהו ב-m/z 131.083 וב-m/z 173.104 כאורניתין (שגיאת מסה של 0.34 ppm; איור 5B) וארגינין (שגיאת מסה של 0.43 ppm; איור 5C), בהתאמה.
ספקטרומטריית מסות של חיידקי מקרוקולטורה בוצעה על מונוקולטורה של C. difficile ועל מושבות C. difficile + E. faecalis (איור 6). תמונה אופטית של הדגימות בעקבות יישום מטריצת MALDI מדגישה את אזורי העניין ברכישה, המשתרעים על האזורים החיצוניים של ביופילמים של מושבות (איור 6A,C). ספקטרומטריית מסות הדמיה של הדגימות האלה מאפשרת מיפוי מרחבי של מטבוליטים של חומצות אמינו אורניתין וארגינין, אשר נמצאו משתנים וממוקמים באופן דיפרנציאלי בנוכחות E. faecalis (איור 6B,D). לדוגמה, ארגינין נפוץ יותר באופן משמעותי במונוקולטורה של C. difficile בהשוואה לתרבות המשותפת C. difficile + E. faecalis (איור 6D). הרחבנו גם את ניתוחי ספקטרומטריית המסה של הדמיה למודלים עכבריים של זיהום באמצעות נקבות עכברים C57BL/6 נטולות חיידקים בנות 8 שבועות שנדבקו בנבגי C. difficile, שניהם נבגי C. difficile + E. faecalis cells (wt) (5 × 10 8/mL), או מוטנט טרנספוזון המכיל את שני נבגי C. difficile + E. faecalis (מוטנט ArcD) תאים (5 × 108/mL) (איור 7)27 . צקום העכבר נקטף והוקפא בתרכובת OCT של 25% כדי לשמור על צורת האיברים ונאמנותם. תרכובת OCT סייעה גם לתמוך בחלקי הרקמה הדקים במהלך הקפאה. בדומה לפרוטוקול שהוזכר לעיל, מקטעי רקמות מצופים בשכבת מטריצה DAN MALDI, נסרקים באמצעות סורק אופטי שטוח (איור 7B), ומנותחים על ידי ספקטרומטריית מסות הדמיה MALDI (איור 7C). צביעה היסטולוגית בוצעה על קטעי רקמות לאחר ניתוח ספקטרומטריית מסות הדמיה, וסריקה אופטית ברזולוציה גבוהה של שדה בהיר שימשה להערכת מורפולוגיה של רקמות (איור 7A). שכבת תאי האפיתל מודלקת בבירור במהלך ההדבקה בהשוואה לרקמת הביקורת.
איור 1: מכשיר ייבוש ואקום ביתי. מכשיר ייבוש ואקום שנבנה בהתאמה אישית משמש לזירוז הסרת לחות מדגימות אגר. הדגימות מוכנסות לתא הוואקום, אשר נאטם ומפונה באמצעות משאבת שדרה סיבובית, ולאחר מכן מחומם באמצעות שנאי מתח משתנה. אדים/נבגים מזהמים מהדגימה נלכדים במלכודת הקור ובמסננים המובנים של HEPA. לחצים של 100-150 mTorr מופעלים בדרך כלל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ייבוש והכנה של מקרו-מושבות חיידקים. תמונות אופטיות של דגימות אגר (A) לפני ואחרי הסרת לחות באמצעות ייבוש וייבוש בעזרת ואקום. (C) מטריצה של 1,5-diaminonaphthalene MALDI מיושמת על תרבית החיידקים לאחר ייבוש באמצעות מרסס רובוטי. (D) ייבוש לא מוצלח גורם בדרך כלל לסדקים ולבעבוע בתוך האגר, מה שהופך אותו לבלתי שמיש לניתוח נוסף. קיצורים: DAN = 1,5-diaminonaphthalene; MALDI = ספיחה/יינון לייזר בסיוע מטריצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ריסוס רובוטי של מטריצת MALDI על דגימות אגרוז. תמונות של (A) מרסס HTX M5 TM ו-(B) דגימות אגרוז שהוטענו לתוך מרסס המטריצה הרובוטי עבור יישום מטריצה MALDI. קיצור: MALDI = ספיחה/יינון לייזר בסיוע מטריצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מתאם ספקטרומטר מסה עם דגימות טעונות לניתוח. דגימות אגרוז מצופות מטריצה נטענות לתוך מתאם שקופיות MTP לניתוח MALDI. סמני פידוקיאל נראים כסימני פלוס שחורים ("+"). קיצור: MALDI = ספיחה/יינון לייזר בסיוע מטריצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ספקטרום מסה מייצג של שיאי יוני מטבוליטים מזוהים. (A) מצב יונים שליליים ניתוח MALDI של דגימות תרבית חיידקים מאפשר זיהוי של עשרות מטבוליטים. מדידות מסה מדויקות ברזולוציה גבוהה מאפשרות זיהוי טנטטיבי של (B) אורניתין ב-m/z 131.083 (שגיאת מסה של 0.34 ppm) ו-(C) ארגינין ב-m/z 173.104 (שגיאת מסה של 0.43 ppm). ספקטרום מסות נרכש באמצעות כוח פתרון מסה (FWHM) של 75,000 ב-m/z 150. קיצורים: MALDI = ספיחה/יינון לייזר בסיוע מטריצה; FWHM = רוחב מלא בחצי מקסימום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: ניתוח ספקטרומטריית מסות הדמיה של מושבות מקרו חיידקיות. (A,C) תמונות אופטיות של דגימות אגרוז מראות את אזורי המדידה לניתוח ספקטרומטריית מסות הדמיה, המודגשים בקווים מקווקווים לבנים. (ב,ד) תמונות יון MALDI עבור אורניתין (m/z 131.083, 0.038 ppm) וארגינין (m/z 173.104, 0.60 ppm) מציגות פיזור מרחבי ייחודי בין תרביות החיידקים. שימו לב שסולמות העוצמה המוחלטת שונים עבור תמונות יוני התרבות המשותפת המוצגות בלוחות B ו-D. לדוגמה, ארגינין נפוץ באופן משמעותי יותר במונוקולטורה C. difficile ביחס לתרבות המשותפת בלוחות C ו-D, כלומר סולם עוצמה זה הוא יחסי לשפע של ארגינין במונוקולטורה, ונראה כי אין ארגינין נוכח בתרבות משותפת זו. לעומת זאת, התרבות המשותפת ב-A וב-B מקרינה את עוצמת הארגינין על סולם עוצמה אבסולוטית נמוך יותר, שכן זהו הדגימה היחידה בתמונה. קיצורים: MALDI = ספיחה/יינון לייזר בסיוע מטריצה; CASI = הצטברות מתמשכת של יונים נבחרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: ניתוח ספקטרומטריית מסות הדמיה של רקמות צקליות מורין נגועות . (A) תמונות מיקרוסקופ ברייטפילד של רקמות המוכתמות בהמטוקסילין ובאאוזין מעכבר נגוע CECA מאפשרות הדמיה של מורפולוגיה של רקמות. (B) תמונות אופטיות של רקמות ceca עכבר מראות את הדגימות לאחר יישום שכבת מטריצה DAN MALDI. (C) תמונות יוני MALDI עבור אורניתין (m/z 131.083, 0.88 ppm) וארגינין (m/z 173.104, 0.15 ppm) מציגות פיזור מרחבי ייחודי בין דגימות הרקמה. קיצורים: MALDI = ספיחה/יינון לייזר בסיוע מטריצה; DAN = 1,5-diaminonaphthalene. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במהלך ספקטרומטריית מסות הדמיית MALDI, חשוב שיהיה משטח דגימה שטוח כדי לספק קוטר מוקד עקבי של לייזר MALDI האירוע על מצע הדגימה. סטיות בגובה הדגימה עלולות לגרום לקרן הלייזר MALDI לצאת מהמיקוד, ולגרום לשינויים בקוטר הקרן ובעוצמה, שיכולים להשפיע על יעילות היינון של MALDI. שינויים אלה ביעילות היינון יכולים לגרום להבדלים בעוצמת האנליזה על פני פני הרקמה, שאינם משקפים את הביוכימיה של הרקמה הבסיסית, אלא משקפים את טופוגרפיית פני השטח. בנוסף, רוב מקורות היינון של MALDI פועלים בלחצים תת-אטמוספריים, ודגימות אגר לחות הן דגימות שבריריות כאשר הן נתונות בתנאי ריק . הוואקום של מקורות אלה יכול לגרום להתייבשות של דגימות אגרוז, אשר יכול לשנות את פני הדגימה במהלך הייבוש. דגימות המכילות כיסי אוויר או כמויות גדולות של מים רגישות מאוד לשינויים אלה. בעיה זו נפוצה במהלך ניתוח ספקטרומטריית מסה של הדמיית MALDI של דגימות חיידקים שגדלו על אגר. אגר מזין יש תכולת מים גבוהה כדי להקל על צמיחת חיידקים; עם זאת, חיוני להסיר לחות רבה ככל האפשר לפני החלת ציפוי מטריצה MALDI והצגת הדגימה לריק של ספקטרומטר המסות.
לכן דגימות אגר מיובשות אינן תורמות בניתוח vacuo . בנוסף לשינויים מורפולוגיים הנגרמים על ידי בתנאי vacuo , קיימות גם בעיות פוטנציאליות הקיימות בגבהי דגימה הבולטים רחוק מדי ממתאם השקופיות של צלחת המטרה MALDI, המשמש להחזקת הדגימה המותקנת על שקופית המיקרוסקופ והבאתה למיקום הנכון עבור מוקד הלייזר MALDI. מנגנון שלב MALDI מוסק היטב עם רכיבים מכניים אחרים של הבמה, ובעודו במקומו, יש מרווח של מילימטרים ספורים בלבד בין פני השטח של לוח המטרה של הדגימה לבין הקצה הקדמי של אופטיקת מקור היונים. זה יכול לגרום גירוד של הדגימה, אשר יכול להזיז או לחלוטין לפרוק את הדגימה להיות מנותח. יתר על כן, בעוד דגימות אגר hydrated להידבק באופן טבעי משטח שקופיות מיקרוסקופ, זה נוטה להיות הרבה יותר חלש מאשר דבקות של דגימת אגר מיובש לחלוטין. לכן, דגימות האגר הלחות בולטות רחוק יותר מפני השטח של לוחית המטרה של הדגימה ויש להן היצמדות חלשה יותר, מה שגורם לסיכון גדול יותר של הדגימה להתפרק ולהתקלף לתוך אופטיקת יון המכשיר במורד הזרם.
הזהות של מטריצת MALDI ובחירת שיטת היישום הם גם משתנים חשובים שיש לקחת בחשבון בניסוי ספקטרומטריית מסות הדמיה. הבחירה של מטריצה MALDI אורגנית תלויה במידה רבה במצע המדגם ובתרכובות היעד של עניין. לדוגמה, מטבוליטים רבים בעלי משקל מולקולרי נמוך (MW < 300 Da) מורכבים מחומצות אורגניות רבות, פוספטים ומויאטים אחרים, אשר מיוננים בקלות רבה יותר בקוטביות השלילית28. עבור ניתוח מצב שלילי, מטריצות בסיסיות עדיפות, כך שהמבנים הכימיים שלהן נוחים יותר לקבלת פרוטון (למשל, 9-aminoacridine, 1,5-diaminonapthalene), ולכן משאירים מטען שלילי על יונים רבים בעלי מטבוליטים קטנים בעלי עניין. ביצענו מסך מטריצה עבור האנליטים הממוקדים המעניינים ומצאנו כי מטריצת 1,5-diaminonapthalene (DAN) הפיקה את האות הגבוה ביותר עבור מטבוליטים של חומצות אמינו בעלי עניין עבור דגימות רקמת ביקורת. במהלך יישום מטריצה MALDI, אנליטים בעלי עניין מופקים ממצע הדגימה ומתגבשים יחד עם מטריצת MALDI. במקרים מסוימים, תנאי יישום מטריצה "רטובים" יותר יאפשרו מיצוי מוגבר והתגבשות משותפת, וכתוצאה מכך זיהוי אנליטי משופר בניתוח MALDI. עם זאת, אם תהליך יישום המטריצה משתמש ביותר מדי ממס, אנליטים עשויים להיות delocalized בתוך הרקמה. חשוב לאזן בין מיצוי אנליטי יעיל לבין שמירה על נאמנות מרחבית של אנליטים ברקמה בעת בחירת התנאים ליישום מטריצה. לדוגמה, ניתן להשתמש במנגנון סובלימציה שנבנה בהתאמה אישית כדי ליישם שכבת מטריצה הומוגנית על משטחי דגימה ומייצר גבישי מטריצה קטנים במיוחד בגודל29,30. עם זאת, תהליך זה הוא יבש למדי ולא יכול להיות אופטימלי עבור מיצוי אנליטי31. המרסס הרובוטי המשמש כאן מספק שליטה ניתנת לשחזור ומדויקת של לחץ הריסוס, קצב הזרימה, טמפרטורת הזרבובית ופרמטרים אחרים שיכולים לאפשר שיטות אופטימליות של מיצוי אנליטי והתגבשות משותפת של מטריצה32.
הפרמטרים האינסטרומנטליים ב- FTICR MS המשמשים כאן עברו אופטימיזציה להעברה וזיהוי של יוני מטבוליט במצב יונים שליליים. זה כולל כוונון רכיבי RF ו- DC באזור העברת היונים כדי להעביר יונים בעלי משקל מולקולרי נמוך (<m/z 200). פרמטרים שיש להם השפעה גדולה על העברת יונים כוללים את משרעת RF של המשפך (65 V), הגדרת המסה Q1 לבידוד יוני מסנן מסה מרובעת (m/z 150), ועיכוב זמן הטיסה בין תא הצטברות הקספול לתא ICR (0.400 מילישניות). ערכי פרמטרים נבחרים אלה מעבירים ביעילות רבה יותר יונים בעלי ערכי m/z נמוכים על חשבון יעילות השידור של יונים בעלי ערכי m/z גדולים יותר. יתר על כן, השתמשנו בגישת צבירה מתמשכת של יונים נבחרים (CASI), המאפשרת העשרה סלקטיבית של יונים בחלון עניין מסה מוגדר. בגישה זו, מסנן המסה המרובעת משמש להעברה סלקטיבית של טווח קטן של ערכי m/z ממקור היינון לתא הצבירה המשושה במכשיר, בעוד שיונים עם ערכי m/z מחוץ לחלון מסה זה הם בעלי מסלולי יונים לא יציבים ואינם מועברים דרך מסנן המסה המרובעת. זה מאפשר העשרה סלקטיבית של אנליזות בעלות שפע נמוך של עניין כדי לשפר את גבול הגילוי והטווח הדינמי בעד שלושה סדרי גודל באמצעות סילוק רעש כימי. כוח פתרון המסה הגבוה ודיוק המסה של פלטפורמת מכשירי FTICR מאפשרים הפרדה קלה של תרכובות איזובריות (כלומר, אותה מסה נומינלית) וזיהוי טנטטיבי של מטבוליטים.
בקרה זהירה וניתנת לשחזור של הכנת הדגימה, יישום מטריצת MALDI וניתוחי ספקטרומטריית מסה של הדמיה יכולים לאפשר תצוגות ניתנות לשחזור של ביוכימיה חיידקית במושבות ובדגימות רקמות. מקרו-מושבות חיידקים משמשות כמודלים פשוטים לאפיון תקשורת צולבת מטבולית של פתוגנים במהלך זיהום מיקרוביאלי, אשר לאחר מכן ניתן להשוות למערכות מורכבות יותר כגון רקמות בעלי חיים. לדוגמה, ארגינין נמצא בשפע נמוך בדגימת התרבית המשותפת C. difficile + E. faecalis בהשוואה לתרבית C. difficile בלבד (איור 6), אשר נתמכת על-ידי יכולתו הידועה של E. faecalis לצרוך ארגינין כמקור אנרגיה ולייצא אורניתין מהתא דרך ArcD antiporter33. תוצאות המקרוקולוניה הובילו לחקירת רגולציה זו של חומצות אמינו במודל של בעלי חיים. עכברים שנדבקו ב-C. difficile + E. faecalis (wt) הראו באופן משמעותי פחות ארגינין מאשר עכברים שנדבקו ב-C. difficile בלבד (איור 7C), מה ששיחזר את תוצאות תמונת המושבה.
כדי לבחון את ההשערה של מטבוליזם ארגינין ואת מעורבותו של האנטיפורטר ArcD, השתמשנו במוטנט טרנספוזון שמחסל את העברת המטבוליטים דרך האנטיפורטר ArcD של E. faecalis. עכברים שנדבקו ב-C. difficile + E. faecalis (arcD::Tn) מראים עלייה בזיהוי ארגינין וירידה בזיהוי אורניתין ביחס למודל הזיהום המשותף מסוג פרא (איור 7C), ובאופן כללי מצילים את רמות חומצות האמינו המקוריות שנצפו במודל של זיהום C. difficile בלבד (איור 7A). קשר הפוך זה של ויסות מטבוליטים מאשש את הממצאים כי E. faecalis צולב ניזון על חומרים מזינים חומצות אמינו המיוצרים C. difficile. יתר על כן, ניתוח היסטולוגי הראה נזק תאי נרחב מעכברים שנדבקו הן ב- C. difficile והן ב- E. faecalis, אשר נצפה בעיקר בזן הבר של E. faecalis בניגוד למוטציה ArcD transposon. תוצאות אלה תומכות בממצאים האחרונים שלנו כי ארגינין ואורניתין הם המפתח לאלימות, התנהגות והתנהגות של C. difficile
כושרגופני 27. בסך הכל, תהליך עבודה זה מדגים שיטה יעילה להכנת מקרומושבות חיידקים מבוססות אגר עבור ספקטרומטריית מסות הדמיה MALDI ומראה כי מערכות אלה יכולות לשמש כמודלים שימושיים לבחינת שיתוף פעולה מיקרוביאלי במהלך זיהום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) המכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים (NIGMS) תחת הפרס GM138660. J.T.S. נתמך על ידי מלגת הקיץ של משפחת צ'ארלס ומוניקה בורקט מאוניברסיטת פלורידה. J.P.Z. נתמך על ידי מענקי NIH K22AI7220 (NIAID) ו- R35GM138369 (NIGMS). ABS נתמך על ידי מענק הכשרה לביולוגיה תאית ומולקולרית באוניברסיטת פנסילבניה (T32GM07229).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm Titan3 nylon syringe filters | Thermo Scientific | 42225-NN | |
| 1,5-diaminonaphthalene MALDI matrix | Sigma Aldrich | 2243-62-1 | |
| 20 mL Henke Ject luer lock syringes | Henke Sass Wolf | 4200.000V0 | |
| 275i series convection vacuum gauge | Kurt J. Lesker company | KJL275807LL | |
| 7T solariX FTICR mass spectrometer equipped with a Smartbeam II Nd:YAG MALDI laser system (2 kHz, 355 nm) | Bruker Daltonics | ||
| Acetic acid solution, suitable for HPLC | Sigma Aldrich | 64-19-7 | |
| Acetonitrile, suitable for HPLC, gradient grade, ≥99.9% | Sigma Aldrich | 75-05-8 | |
| Ammonium hydroxide solution, 28% NH3 in H2O, ≥99.99% trace metals basis | Sigma Aldrich | 1336-21-6 | |
| Autoclavable biohazard bags: 55 gal | Grainger | 45TV10 | |
| Biohazard specimen transport bags (8 x 8 in.) | Fisher Scientific | 01-800-07 | |
| Brain heart infusion broth | BD Biosciences | 90003-040 | |
| C57BL/6 male mice | Jackson Laboratories | ||
| CanoScan 9000F Mark II photo and document scanner | Canon | ||
| CM 3050S research cryomicrotome | Leica Biosystems | ||
| Desiccator cabinet | Sigma Aldrich | Z268135 | |
| Diamond tip scriber, Electron Microscopy Sciences | Fisher Scientific | 50-254-51 | |
| Drierite desiccant pellets | Drierite | 21005 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2701 | |
| flexImaging software | Bruker Daltonics | ||
| ftmsControl software | Bruker Daltonics | ||
| Glass vacuum trap | Sigma Aldrich | Z549460 | |
| HTX M5 TM robotic sprayer | HTX Technologies | ||
| Indium Tin Oxide (ITO)-coated microscope slides | Delta Technologies | CG-81IN-S115 | |
| In-line HEPA filter to vacuum pump | LABCONCO | 7386500 | |
| Methanol, HPLC Grade | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| MTP slide-adapter II | Bruker Daltonics | 235380 | |
| Optimal cutting temperature (OCT) compound | Fischer Scientific | 23-730-571 | |
| Peridox RTU Sporicide, Disinfectant and Cleaner | CONTEC | CR85335 | |
| PTFE (Teflon) printed slides, Electron Microscopy Sciences | VWR | 100488-874 | |
| Rotary vane vacuum pump RV8 | Edwards | A65401903 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Disposable High Profile Microtome Blades | Electron Microscopy Sciences | 63068-HP | |
| Transparent vacuum tubing | Cole Palmer | EW-06414-30 | |
| Ultragrade 19 vacuum pump oil | Edwards | H11025011 | |
| Variable voltage transformer | Powerstat | ||
| Water, suitable for HPLC | Sigma Aldrich | 7732-18-5 | |
| Wide-mouth dewar flask | Sigma Aldrich | Z120790 |
References
- Biteen, J. S., et al. Tools for the microbiome: nano and beyond. ACS Nano. 10 (1), 6-37 (2016).
- Shreiner, A. B., Kao, J. Y., Young, V. B. The gut microbiome in health and in disease. Current Opinion in Gastroenterology. 31 (1), 69-75 (2015).
- Watrous, J. D., Alexandrov, T., Dorrestein, P. C. The evolving field of imaging mass spectrometry and its impact on future biological research. Journal of Mass Spectrometry. 46 (2), 209-222 (2011).
- Gessel, M. M., Norris, J. L., Caprioli, R. M. MALDI imaging mass spectrometry: spatial molecular analysis to enable a new age of discovery. Journal of Proteomics. 107, 71-82 (2014).
- Fang, J., Dorrestein, P. C. Emerging mass spectrometry techniques for the direct analysis of microbial colonies. Current Opinion in Microbiology. 19, 120-129 (2014).
- Wheatcraft, D. R. A., Liu, X., Hummon, A. B. Sample preparation strategies for mass spectrometry imaging of 3D cell culture models. Journal of Visualized Experiments. (94), e52313 (2014).
- Zink, K. E., Dean, M., Burdette, J. E., Sanchez, L. M. Capturing small molecule communication between tissues and cells using imaging mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (146), e59490 (2019).
- Li, H., Hummon, A. B. Imaging mass spectrometry of three-dimensional cell culture systems. Analytical Chemistry. 83 (22), 8794-8801 (2011).
- Watrous, J. D., Dorrestein, P. C.
- Dunham, S. J. B., Ellis, J. F., Li, B., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging of complex microbial communities. Accounts of Chemical Research. 50 (1), 96-104 (2017).
- Frydenlund Michelsen, C., et al. Evolution of metabolic divergence in Pseudomonas aeruginosa during long-term infection facilitates a proto-cooperative interspecies interaction. Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 10 (6), 1323-1336 (2016).
- Si, T., et al. Characterization of Bacillus subtilis colony biofilms via mass spectrometry and fluorescence imaging. Journal of Proteome Research. 15 (6), 1955-1962 (2016).
- Wakeman, C. A., et al. The innate immune protein calprotectin promotes Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus interaction. Nature Communications. 7, 11951 (2016).
- Phelan, V. V., Fang, J., Dorrestein, P. C. Mass spectrometry analysis of Pseudomonas aeruginosa treated with azithromycin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (6), 873-877 (2015).
- Ferreyra, J. A., et al. Gut microbiota-produced succinate promotes C. difficile infection after antibiotic treatment or motility disturbance. Cell Host & Microbe. 16 (6), 770-777 (2014).
- Buffie, C. G., et al. Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile. Nature. 517 (7533), 205-208 (2015).
- Schubert, A. M., et al. Microbiome data distinguish patients with Clostridium difficile infection and non-C. difficile-associated diarrhea from healthy controls. mBio. 5 (3), 01021-01014 (2014).
- Auchtung, J. M., et al. Identification of simplified microbial communities that inhibit Clostridioides difficile infection through dilution/extinction. mSphere. 5 (4), 00387 (2020).
- Zackular, J. P., et al. Dietary zinc alters the microbiota and decreases resistance to Clostridium difficile infection. Nature Medicine. 22 (11), 1330-1334 (2016).
- Tomkovich, S., Stough, J. M., Bishop, L., Schloss, P. D. The initial gut microbiota and response to antibiotic perturbation influence Clostridioides difficile clearance in mice. mSphere. 5 (5), 00869 (2020).
- Hoffmann, T., Dorrestein, P. C. Homogeneous matrix deposition on dried agar for MALDI imaging mass spectrometry of microbial cultures. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1959-1962 (2015).
- Yang, J. Y., et al. Primer on agar-based microbial imaging mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 194 (22), 6023-6028 (2012).
- Prentice, B. M., et al. Dynamic range expansion by gas-phase ion fractionation and enrichment for imaging mass spectrometry. Analytical Chemistry. 92 (19), 13092-13100 (2020).
- Bemis, K. D., et al. Cardinal: an R package for statistical analysis of mass spectrometry-based imaging experiments. Bioinformatics. 31 (14), 2418-2420 (2015).
- Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. A., Muddiman, D. C. MSiReader: An open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (5), 718-721 (2013).
- Bokhart, M. T., Nazari, M., Garrard, K. P., Muddiman, D. C. MSiReader v1.0: Evolving open-source mass spectrometry imaging software for targeted and untargeted analyses. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (1), 8-16 (2018).
- Smith, A. B., et al. Enterococci enhance Clostridioides difficile Pathogenesis. Nature. , (2022).
- Korte, A. R., Lee, Y. J. MALDI-MS analysis and imaging of small molecule metabolites with 1,5-diaminonaphthalene (DAN). Journal of Mass Spectrometry. 49 (8), 737-741 (2014).
- Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 18 (9), 1646-1652 (2007).
- Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: Enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition. Analytical Chemistry. 84 (4), 2048-2054 (2012).
- Huizing, L. R., et al. Development and evaluation of matrix application techniques for high throughput mass spectrometry imaging of tissues in the clinic. Clinical Mass Spectrometry. 12, 7-15 (2019).
- Anderton, C. R., Chu, R. K., Tolić, N., Creissen, A., Paša-Tolić, L. Utilizing a robotic sprayer for high lateral and mass resolution MALDI FT-ICR MSI of microbial cultures. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (3), 556-559 (2016).
- Gilmore, M. S., Clewell, D. B., Ike, Y., Shankar, N. Enterococci: From commensals to leading causes of drug resistant infection. Massachusetts Eye and Ear Infirmary. , Boston. (2014).
