Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Исследование микробной кооперации с помощью визуализационного масс-спектрометрического анализа бактериальных колоний, выращенных на агаре и в тканях во время инфекции

Published: November 18, 2022 doi: 10.3791/64200
Automatic Translation
1, 2, 2, 2,3, 1
1Department of Chemistry, University of Florida, 2Division of Protective Immunity, Children’s Hospital of Philadelphia, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

Summary

Продемонстрирован новый метод пробоподготовки для анализа бактериальных макроколоний на основе агара с помощью масс-спектрометрии с помощью матричной лазерной десорбции/ионизации.

Abstract

Понимание метаболических последствий микробных взаимодействий, происходящих во время инфекции, представляет собой уникальную проблему для области биомедицинской визуализации. Масс-спектрометрия с матричной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI) представляет собой метод визуализации in situ без меток, способный генерировать пространственные карты для широкого спектра метаболитов. В то время как тонко срезанные образцы тканей в настоящее время регулярно анализируются с помощью этой технологии, визуализационный масс-спектрометрический анализ нетрадиционных субстратов, таких как бактериальные колонии, обычно выращиваемые на агаре в микробиологических исследованиях, остается сложной задачей из-за высокого содержания воды и неровной топографии этих образцов. В этой статье демонстрируется рабочий процесс пробоподготовки, позволяющий проводить масс-спектрометрический анализ этих типов образцов. Этот процесс иллюстрируется с использованием бактериальных макроколоний двух желудочно-кишечных патогенов: Clostridioides difficile и Enterococcus faecalis. Также показано, что изучение микробных взаимодействий в этой четко определенной агаровой среде дополняет исследования тканей, направленные на понимание микробного метаболического взаимодействия между этими двумя патогенными организмами в мышиных моделях инфекции. Визуализационный масс-спектрометрический анализ метаболитов аминокислот аргинина и орнитина представлен в качестве репрезентативных данных. Этот метод широко применим к другим аналитам, микробным патогенам или заболеваниям, а также типам тканей, где требуется пространственная мера клеточной или тканевой биохимии.

Introduction

Микробиом человека представляет собой высокодинамичную экосистему, включающую молекулярные взаимодействия бактерий, вирусов, архей и других микробных эукариот. В то время как микробные отношения интенсивно изучались в последние годы, многое еще предстоит понять о микробных процессах на химическом уровне 1,2. Отчасти это связано с отсутствием инструментов, способных точно измерять сложные микробные среды. Достижения в области масс-спектрометрии визуализации (IMS) за последнее десятилетие позволили проводить пространственное картирование in situ и без меток многих метаболитов, липидов и белков в биологических субстратах 3,4. Матричная лазерная десорбция/ионизация (MALDI) стала наиболее распространенным методом ионизации, используемым в масс-спектрометрии изображений, включающим использование УФ-лазера для удаления материала с поверхности тонкого среза ткани для измерения с помощью масс-спектрометрии4. Этот процесс облегчается применением химической матрицы, равномерно нанесенной на поверхность образца, что позволяет проводить последовательные измерения в растровой схеме по всей поверхности образца. Тепловые карты интенсивности ионов анализируемого вещества затем генерируются после сбора данных. Последние достижения в области источников ионизации и методов отбора проб позволили проанализировать нетрадиционные субстраты, такие как бактериальные5 и 6,7,8 клеточные образцы млекопитающих, выращенные на питательном агаре. Молекулярная пространственная информация, предоставляемая IMS, может дать уникальное представление о биохимической коммуникации взаимодействий микроб-микроб и хозяин-микроб во время инфекции 9,10,11,12,13,14.

При инфекции Clostridioides difficile (CDI) C. difficile подвергается воздействию быстро меняющейся микробной среды в желудочно-кишечном тракте, где полимикробные взаимодействия могут повлиять на исходы инфекции15,16. Удивительно, но мало что известно о молекулярных механизмах взаимодействия между C. difficile и резидентной микробиотой во время инфекции. Например, энтерококки представляют собой класс условно-патогенных микроорганизмов в микробиоме кишечника и связаны с повышенной восприимчивостью и тяжестью CDI 17,18,19,20. Однако мало что известно о молекулярных механизмах взаимодействия между этими патогенами. Чтобы визуализировать низкомолекулярную связь между этими членами кишечного микробиома, бактериальные макроколонии были выращены здесь на агаре для имитации микроб-микробных взаимодействий и образования бактериальной биопленки в контролируемой среде. Однако получение репрезентативных метаболических распределений при масс-спектрометрическом анализе образцов бактериальных культур с помощью MALDI является сложной задачей из-за высокого содержания воды и неровной топографии поверхности этих образцов. Это в значительной степени вызвано высокой гидрофильной природой агара и неравномерной реакцией поверхности агара при удалении влаги.

Высокое содержание воды в агаре также может затруднить получение однородного матричного покрытия MALDI и может помешать последующему анализу MALDI, выполняемому в вакууме21. Например, многие источники MALDI работают при давлении 0,1-10 Торр, что является достаточным вакуумом для удаления влаги из агара и может вызвать деформацию образца. Эти морфологические изменения в агаре, вызванные вакуумной средой, вызывают пузырение и растрескивание в высушенном агаровом материале. Эти артефакты снижают адгезию агара к предметному стеклу и могут привести к демонтажу или отслаиванию образца в вакуумной системе прибора. Толщина образцов агара может составлять до 5 мм от предметного стекла, что может создать недостаточный зазор от ионной оптики внутри прибора, что приведет к загрязнению и/или повреждению ионной оптики прибора. Эти кумулятивные эффекты могут привести к уменьшению ионного сигнала, отражающего топографию поверхности, а не лежащие в основе микробные биохимические взаимодействия. Образцы агара должны быть однородно высушены и прочно приклеены к предметному стеклу микроскопа перед анализом в вакууме.

В данной работе демонстрируется процесс пробоподготовки для контролируемой сушки макроколоний бактериальных культур, выращенных на агаровых средах. Этот многоступенчатый, более медленный процесс сушки (по сравнению с ранее описанными) гарантирует, что агар будет равномерно обезвоживаться, сводя к минимуму эффекты барботирования или растрескивания образцов агара, установленных на предметных стеклах микроскопа. При использовании этого метода постепенной сушки образцы прочно прилегают к предметному стеклу микроскопа и поддаются последующему нанесению матрицы и анализу MALDI. Это проиллюстрировано на примере модельных бактериальных колоний C. difficile , выращенных на моделях агаровой и мышиной ткани, содержащих CDI с присутствием комменсального и условно-патогенного микроорганизма Enterococcus faecalis и без него. Масс-спектрометрический анализ MALDI как бактериальных, так и тканевых моделей позволяет пространственно картировать профили метаболитов аминокислот, обеспечивая новое понимание биоэнергетического микробного метаболизма и коммуникации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты на животных были одобрены комитетами по уходу за животными и их использованию Детской больницы Филадельфии и Медицинской школой Перельмана Пенсильванского университета (протоколы IAC 18-001316 и 806279).

ВНИМАНИЕ: Clostridium difficile (C. difficile) и Enterococcus faecalis (E. faecalis) являются патогенами BSLII, и с ними следует обращаться с особой осторожностью. При необходимости используйте надлежащие протоколы обеззараживания.

1. Рост макроколоний бактериальных культур и подготовка к ночной отправке

  1. Подготовьте культуры C. difficile и E. faecalis на ночь и выращивайте их по отдельности при 37 ° C в анаэробной камере (85% азота, 10% водорода, 5% углекислого газа) в отваре для инфузии мозга и сердца с добавлением 0,5% дрожжевого экстракта и 0,1% l-цистеина (BHIS). Используйте 1,5% агар для всех образцов с покрытием.
  2. Нормализуют бактериальные питательные среды до оптической плотности при 600 нм (OD600). Планшет 5 мкл каждой макроколонии на пластины BHIS + l-цистеиновый агар и анаэробно растет в течение 7 дней при 37 ° C. Для макроколоний смешанных видов смешайте бактериальные питательные среды в соотношении 1:1 перед нанесением покрытия.
  3. Подготовьте предметные стекла микроскопа с покрытием из оксида индия и олова (ITO), используя омметр, чтобы определить сторону предметного стекла с проводящим покрытием. Используйте писец с ромбовидным наконечником, чтобы вытравить и пометить сторону предметного стекла микроскопа с покрытием ITO.
  4. Иссеките всю культуру из пластины для роста агара, а затем установите на предметное стекло микроскопа с покрытием ITO, следя за тем, чтобы пузырьки воздуха не задерживались между агаром и предметным стеклом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Содержание воды в агаровой среде должно позволять культуре естественным образом прилипать к поверхности предметного стекла микроскопа. Видео, иллюстрирующее этот процесс, приведено в дополнительной документации Yang et al.22.
  5. Поместите колонии в предметные стекла микроскопа для защиты. Храните слайд-боксы размером 8 x 8 дюймов в мешках для транспортировки биологически опасных образцов с горсткой гранул влагопоглотителя и запечатывайте их для ночной транспортировки для дальнейшей обработки и анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно поддерживать сухую среду для бактериальных культур при транспортировке в условиях окружающей среды, чтобы замедлить рост и метаболизм бактерий и сохранить фиксацию бактериальных образцов до анализа. Этот метод доставки был оптимизирован в результате обширных экспериментов и предпочтительнее транспортировки колоний, замороженных в сухом льду. Значительные изменения температуры перед сушкой, как правило, вызывают демонтаж и пузырение под установленным образцом агара.

2. Сушка при температуре окружающей среды бактериальных макроколоний C. difficile + E. faecalis

  1. Удалите колонии агарозных бактерий, установленные на предметных стеклах микроскопа с покрытием ITO, из упаковочного материала. Поместите образцы в сухой ящик с влагопоглотителем на 48-72 ч при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это мягкий и медленный процесс сушки, который сводит к минимуму пузырение, растрескивание или отслоение агаровой среды от поверхности предметного стекла микроскопа.
  2. Надлежащим образом утилизируйте весь загрязненный упаковочный материал и обеззаразьте рабочее пространство соответствующим бактерицидным/спороцидным дезинфицирующим средством.
  3. Визуально осмотрите колонии на наличие деформаций на поверхности агара (например, пузыреобразования, растрескивания, спешивания).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Высота поверхности агарозы должна заметно уменьшаться и лежать ровно поперек предметного стекла.

3. Вакуумная и термоопосредованная сушка бактериальных макроколоний C. difficile + E. faecalis

ПРИМЕЧАНИЕ: Изготовленный по индивидуальному заказу вакуумный сушильный аппарат (рис. 1) был построен для облегчения удаления избыточной влаги из образцов агара. В этом аппарате используется пластинчато-роторный вакуумный насос, подключенный по линии к биофильтру HEPA, холодная ловушка и камера из нержавеющей стали, куда помещаются образцы бактерий. Трансформатор переменного напряжения подключен к изолированной проволочной нити, что позволяет пользователю нагревать камеру для ускорения процесса сушки.

  1. Закройте вакуумную линию с камерой для отбора проб и включите выключатель питания пластинчато-роторного насоса , чтобы вакуумный насос нагрелся и достиг надлежащего вакуумного давления.
  2. Включите трансформатор переменного напряжения , чтобы нагреть нить накаливания провода, обернутую вокруг камеры. Отрегулируйте переменный источник питания до тех пор, пока внутренняя температура вакуумной камеры не достигнет ~50 °C. Пока насос прогревается, поместите суспензию сухого льда и 100% этанола в конденсатор холодной ловушки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Холодная ловушка конденсирует любые пары или споры из образца и предотвращает загрязнение системы пластинчато-роторного насоса и масла вакуумного насоса.
  3. Откройте вакуумную камеру с помощью гаечного ключа, чтобы ослабить 16-миллиметровые зажимы фланца с двойным кулачком. Вставьте образцы агарозы в камеру и плотно закройте камеру с помощью 16-миллиметровых зажимов с двойным кулачковым фланцем.
  4. Откройте клапан насоса, чтобы опорожнить камеру. Дайте образцам высохнуть в течение 60-120 минут (например, при ~150 мТорр).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этого времени сушки достаточно, чтобы удалить большую часть влаги из небольших секций агара. Эмпирическое определение оптимального времени сушки для удаления влаги и уменьшения высоты агара может потребоваться в зависимости от индивидуальной установки и образцов. Значительно более длительное время сушки может привести к тому, что сушеный агар станет хрупким и склонным к растрескиванию.
  5. Когда закончите, медленно выпустите вакуумную камеру под давлением окружающей среды, закрыв клапан пластинчато-роторного насоса и открыв внешний клапан для окружающего воздуха. Откройте камеру по ранее указанному протоколу и извлеките высушенный образец агарозы из камеры.
  6. Храните образец в сухом ящике с влагопоглотителем до нанесения матрицы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2 показаны изображения поверхности агара до и после сушки.

4. Нанесение матрицы MALDI с помощью роботизированного распыления

ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как образцы агарозы были тщательно высушены и высота срезов культуры заметно уменьшилась, используйте роботизированный матричный распылитель для равномерного нанесения тонкого покрытия химического матричного соединения MALDI. Эту процедуру следует выполнять в химическом вытяжном шкафу и с надлежащими средствами индивидуальной защиты, включая перчатки, лабораторные очки и лабораторный халат.

  1. Выберите соответствующую матрицу MALDI. Чтобы следовать этому протоколу, используйте матрицу 1,5-диаминонафталина (DAN) MALDI для ее благоприятной десорбции и ионизации аминокислот в режиме отрицательных ионов.
  2. Приготовьте 10 мл матричного раствора dan maldi 10 мг/мл в 90/10 (об./об.) ацетонитрила/воды. Используйте растворители класса ВЭЖХ, обрабатывайте ультразвуком в течение 30 минут и фильтруйте раствор через нейлоновые шприцевые фильтры 0,2 мкм перед введением в шприцевой насос роботизированного распылителя. Кроме того, готовьте моющие растворы, чтобы обеспечить чистоту линии опрыскивателя между каждым использованием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Промывочные растворы выбираются для повышения растворимости матрицы и других загрязнений в линии опрыскивателя и облегчения их удаления из системы. Промывочные растворы, используемые в настоящем описании, представляют собой 90/10 (об./об.) ацетонитрил/вода, 50/50 (об./об.) вода/метанол, 99/1 (об./об.) ацетонитрил/уксусная кислота и 95/5 (об./об.) вода/гидроксид аммония.
  3. Приложите образец к поддону опрыскивателя и загрузите приготовленные растворы в линию опрыскивателя (рисунок 3). Используя компьютерное программное обеспечение, укажите необходимые параметры, чтобы обеспечить равномерное покрытие матричного компаунда: температура сопла 30 °C, восемь проходов, расход 0,1 мл/мин, схема CC, время высыхания 0 с, 10 фунтов на квадратный дюйм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общепризнано, что большинство патогенов будут инактивированы путем применения матрицы MALDI, которая обычно представляет собой небольшую органическую кислоту или основание.
  4. После завершения распыления извлеките образец из поддона опрыскивателя и храните в сушильном шкафу до анализа.

5. Подготовка бактериальных макроколоний к получению данных масс-спектрометрии MALDI

ПРИМЕЧАНИЕ: Все масс-спектрометрические анализы изображений были выполнены с использованием масс-спектрометра ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (FTICR). Этот прибор оснащен лазерной системой Nd:YAG MALDI (2 кГц, 355 нм).

  1. Вставьте образец с матричным покрытием в адаптер предметного стекла микроскопа-мишени MALDI и нанесите не менее трех фидуциальных маркеров, охватывающих область образца, с помощью перманентных маркеров (рис. 4). Используйте планшетный сканер для получения оптического изображения предметного стекла микроскопа, включая реперные маркеры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фидуциальные маркеры позволяют регистрировать оптическое изображение в виде камеры MALDI, наблюдаемом в приборе.
  2. Определите метод прибора MS, оптимизированный для желаемого диапазона масс, чувствительности и разрешения, который включает калибровку массы, настройки лазера MALDI, параметры ионной оптики и условия ячейки ICR. Для этого метода выберите окно масс 100 Да от m/z 100 до 200 для обогащения газофазного сигнала в режиме отрицательных ионов с использованием подхода непрерывного накопления выбранных ионов (CASI),23 который охватывает значения m/z интересующих метаболитов.
  3. Откройте программное обеспечение прибора для получения изображений и используйте мастер настройки , чтобы определить имя и местоположение файла, метод сбора MS, области интереса для выборки и пространственное разрешение изображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пространственное разрешение 100-300 мкм обычно используется для визуализации бактериальных макроколоний.
  4. После того, как все параметры определены, запустите последовательность сбора данных, чтобы последовательно получить масс-спектр на каждом пикселе в определенной области (областях) интереса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время получения изображения зависит от настроек прибора, но обычно составляет от 2 до 6 часов для изображений, содержащих 5 000-10 000 пикселей.

6. Визуализация масс-спектрометрии, анализ данных и идентификация соединений

  1. После получения изображения сохраните данные с расширением файла «.mis», который является форматом файла для конкретных поставщиков для платформ масс-спектрометрии изображений. Откройте файл данных в программных пакетах flexImaging или SCiLS или экспортируйте его в непатентованный формат данных, такой как .mzml, и визуализируйте с помощью независимого от производителя программного обеспечения (например, Cardinal24 или MSIreader25,26).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При открытии данных изображения в flexImaging отображается средний масс-спектр, который представляет собой среднюю интенсивность всех ионов, обнаруженных в отобранных областях. Пики, представляющие интерес, могут быть предварительно идентифицированы на основе точных измерений массы. Как правило, погрешность массы более 5 частей на миллион (ppm) достаточна для идентификации метаболитов на масс-спектрометрах FTICR.
  2. Используя указанное программное обеспечение, определите окна масс для интересующих пиков для создания тепловых карт распределения ионов по отобранным областям с ложными цветами.
    1. На дисплее среднего масс-спектра увеличьте масштаб до интересующего пика и выберите соответствующее окно массы, охватывающее область профиля пика.
    2. Щелкните правой кнопкой мыши выделенное массовое окно и выберите « Добавить массовый фильтр...». Пометьте выбранное значение m/z , используя предварительную идентификацию предполагаемого метаболита, определяемую точным измерением массы с высоким разрешением.
    3. Выберите порог интенсивности , чтобы настроить динамический диапазон изображения анализируемого вещества, отображаемого тепловой картой ложных цветов. Далее отрегулируйте параметры фильтрации массы так, чтобы окно массы охватывало область профиля пика, а затем добавьте фильтр массы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нормализация интенсивности может быть выполнена по мере необходимости для улучшения относительной количественной оценки в измеряемых областях. В экспериментах здесь использовался сбор данных CASI (см. ниже), что может сделать методы нормализации общего количества ионов (TIC) и среднеквадратичного (RMS) неточными. Таким образом, все изображения ионов, показанные здесь, отображаются без нормализации.

7. Подготовка и отгрузка неинфицированных контрольных и инфицированных C. difficile тканей слепой кишки мыши

  1. Прививают 4-8-недельных мышей-самцов C57BL/6 антибиотиками (0,5 мг/мл цефоперазона или 0,5 мг/мл цефоперазона + 1 мг/мл ванкомицина) в питьевой воде ad libitum в течение 5 дней с последующим 2-дневным периодом выздоровления и последующим заражением.
  2. Усыпьте животных путем удушения CO2 и немедленно извлеките слепую кишку мыши. Добавьте в дистиллированную воду 20%-ную смесь с оптимальной температурой резки (OCT).
  3. Поместите образцы на сухой лед, а затем упакуйте и отправьте на анализ; хранить при температуре -80 °C до анализа.

8. Криоссекция неинфицированных контрольных тканей слепой кишки мыши Verus C. difficile

  1. Очистите все криосекционное оборудование, промыв его 100% этанолом, и дайте высохнуть перед помещением образцов в криостатную камеру. Подготовьте предметные стекла микроскопа с покрытием ITO, используя омметр, чтобы определить сторону предметного стекла с проводящим покрытием. Используйте писец с ромбовидным наконечником, чтобы вытравить и пометить сторону предметного стекла микроскопа с покрытием ITO.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следует носить надлежащие средства индивидуальной защиты, включая перчатки, лабораторные очки, лабораторный халат и криостатные рукава.
  2. Проведите криоссекцию на исследовательском криомикротоме. Перенесите ткани слепой кишки мыши со встроенным ОКТ из морозильной камеры с температурой -80 °C в камеру криомикротома (температура камеры 30 °C, температура объекта -28 °C) на сухом льду. Установите образцы тканей для сравнения с помощью масс-спектрометрии визуализации (например, неинфицированный контроль и инфицированный C. difficile) на одно и то же предметное стекло микроскопа, чтобы обеспечить идентичную подготовку образцов обоих типов тканей и обеспечить точное сравнение метаболитов.
  3. Внутри камеры криомикротома установите ткань, встроенную в ОКТ, на патрон для образца с помощью дополнительного раствора ОКТ. После того, как раствор OCT затвердеет, закрепите патрон на головке образца. Начните криоссекцию с шагом 10-50 мкм, чтобы достичь желаемой глубины ткани / плоскости органа.
  4. Как только будет достигнуто оптимальное поперечное сечение ткани, приступайте к сбору срезов толщиной 12 мкм. Аккуратно обработайте срез с помощью кистей художника и поместите его на предметное стекло микроскопа с тефлоновым покрытием.
  5. Прокатите предметное стекло микроскопа с покрытием ITO поверх секции ткани, чтобы собрать ткань с предметного стекла с тефлоновым покрытием. Оттаивание Прикрепите срез ткани к предметному стеклу микроскопа, прижав ладонь к задней части предметного стекла с покрытием ITO. Продолжайте размораживать до тех пор, пока участок ткани не перейдет из полупрозрачного в непрозрачный/матовый цвет.
  6. Перенесите предметные стекла микроскопа, установленные на ткани, на сухом льду в сухую коробку с влагопоглотителем для хранения для анализа в тот же день или храните при температуре -80 °C для более длительного хранения.

9. Подготовка неинфицированных контрольных тканей слепой кишки мыши по сравнению с инфицированными C. difficile тканями слепой кишки для матричного применения и масс-спектрометрии визуализации MALDI

  1. Выполните матричное нанесение MALDI, используя тот же протокол, который описан на шаге 4 (температура сопла 30 ° C, восемь проходов, расход 0,1 мл / мин, схема CC, время сушки 0 с, 10 фунтов на квадратный дюйм).
  2. Выполните масс-спектрометрию изображений MALDI, используя те же протоколы, которые описаны в шагах 5 и 6.
  3. Проанализируйте ионные изображения из нескольких биологических реплик и сравните результаты на значимость с помощью сравнения диаграмм интенсивности с использованием статистического программного обеспечения SCiLS, упомянутого выше.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующие статистические тесты и сравнения будут зависеть от приложения и могут включать пространственную сегментацию, классификационные модели и сравнительный анализ для определения дискриминативных и коррелированных спектральных признаков. Сравнительный анализ может включать в себя присвоение p-значений значимым признакам, проведение анализа главных компонентов для сравнения тканей и визуализацию прямоугольных диаграмм для выявления вариаций. Также полезно визуализировать ткань с помощью светлопольной микроскопии участка ткани, окрашенного гематоксилином и эозином (H & E) после визуализационной масс-спектрометрии. Это позволяет четко идентифицировать морфологические особенности ткани и может быть проанализировано после консультации с квалифицированным патологоанатомом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы провели масс-спектрометрию метаболитов MALDI модельных бактериальных колоний и мышей, колонизированных совместно с E. faecalis и C. difficile , для изучения роли аминокислот во взаимодействиях микробов и микробов. Бактериальные макроколонии, выращенные на агаре, служат четко определенной моделью для анализа отчетливых биохимических изменений в образовании бактериальной биопленки. Важно обеспечить контролируемый процесс сушки макроколоний бактериальных культур, выращенных на агаровой среде, чтобы свести к минимуму деформации и растрескивание поверхности агара. Это было достигнуто с помощью двухступенчатого процесса, включающего предварительную сушку с помощью влагопоглотителя при температуре и давлении окружающей среды, за которой следует более быстрая стадия вакуумной сушки, выполняемая при повышенной температуре. Специально изготовленный сушильный аппарат использовался для облегчения обезвоживания агара при улавливании выброса любых бактериальных загрязнителей или спор из образцов (рис. 1). Дополнительный этап вакуумной сушки необходим для обеспечения полного обезвоживания образцов и их деформации при воздействии вакуума MS.

Срезы агара первоначально имели высоту образца 2-4 мм (рис. 2А) и были уменьшены до ~0,5 мм в высоту в соответствии с протоколом сушки (рис. 2В). Важно обеспечить равномерное высыхание по всей поверхности образца во время этого протокола пробоподготовки. Большие колебания высоты образца приведут к расфокусированному лазерному лучу MALDI на поверхности образца, что может отрицательно сказаться на эффективности ионизации и результирующей интенсивности ионов анализируемого вещества. Пример неудачного процесса сушки показан на рисунке 2D, где поверхность агара пузырится и трескается, что делает образец непригодным для дальнейшего анализа. После того, как бактериальный образец был тщательно высушен, с помощью роботизированного распылителя наносится матричный слой DAN MALDI (рис. 3). Этот прибор позволяет точно контролировать параметры распыления, что позволяет наносить однородное матричное покрытие (рис. 2C).

После нанесения матрицы предметные стекла микроскопа, содержащие образцы, вставляются в адаптер предметного стекла для анализа на FTICR MS (рис. 4). Координаты на предметном стекле регистрируются между программным обеспечением для получения изображений масс-спектрометрии и камерой прибора путем предварительного рисования реперных меток на предметном стекле вокруг измеряемых областей (обозначаются символами «+» на рисунке 4). Затем слайд сканируется в цифровом виде с помощью планшетного сканера для записи оптического изображения, которое затем используется для определения последовательности сбора данных в программном обеспечении flexImaging. Мы оптимизировали настройки масс-спектрометрического прибора для передачи и обнаружения анионов метаболитов. Используя обогащение ионов в газовой фазе CASI, было определено окно выделения ионов для селективного накопления ионов при m/z 150 ± 50 Да (рис. 5A), которое содержит массив соединений, наблюдаемых на поверхности ткани. В частности, здесь для инфекции C. difficile мы обнаружили аминокислотные пути, чтобы продемонстрировать интересные и меняющиеся роли во время бактериального катаболизма. На основании точных измерений массы было установлено, что ионные сигналы при m/z 131,083 и m/z 173,104 являются орнитином (погрешность массы 0,34 ppm; Рисунок 5В) и аргинин (массовая погрешность 0,43 ppm; Рисунок 5С) соответственно.

Визуализационная масс-спектрометрия бактериальных макроколоний проводилась на монокультурах C. difficile и на колониях кокультур C. difficile + E. faecalis (рис. 6). Оптическое изображение образцов после нанесения матрицы MALDI выделяет интересующие области приобретения, которые простираются до внешних областей биопленок колоний (рис. 6A, C). Визуализация масс-спектрометрии этих образцов позволяет пространственно картировать метаболиты аминокислот орнитина и аргинина, которые, как было обнаружено, изменены и дифференциально локализованы в присутствии E. faecalis (рис. 6B, D). Например, аргинин значительно более распространен в монокультуре C. difficile по сравнению с кокультурой C. difficile + E. faecalis (рис. 6D). Мы также расширили визуализирующий масс-спектрометрический анализ на мышиные модели инфекции с использованием 8-недельных бесмикробных самок C57BL / 6 мышей, которые были инфицированы либо спорами C. difficile, либо спорами C. difficile + клетками E. faecalis (масса) (5 × 108 / мл), либо транспозонным мутантом, содержащим обе споры C. difficile + клетки E. faecalis (мутант ArcD) (5 × 108 / мл) (рис. 7)27 . Слепая кишка мыши была собрана и заморожена в 25% соединении ОКТ для поддержания формы и точности органа. Соединение ОКТ также помогло поддержать тонкие срезы тканей во время криосекции. Подобно протоколу, упомянутому выше, срезы ткани покрываются матричным слоем DAN MALDI, сканируются с помощью планшетного оптического сканера (рис. 7B) и анализируются с помощью масс-спектрометрии изображений MALDI (рис. 7C). Гистологическое окрашивание проводили на срезах тканей после масс-спектрометрического анализа изображений, а для оценки морфологии тканей использовалось оптическое сканирование светлого поля с высоким разрешением (рис. 7A). Слой эпителиальных клеток явно воспаляется во время инфекции по сравнению с контрольной тканью.

Figure 1
Рисунок 1: Самодельный вакуумный сушильный аппарат. Изготовленный по индивидуальному заказу вакуумный сушильный аппарат используется для ускорения удаления влаги из образцов агара. Образцы помещают в вакуумную камеру, которая герметизируется и откачивается с помощью пластинчато-роторного насоса, а затем нагревается с помощью трансформатора переменного напряжения. Любые загрязняющие пары/споры из образца задерживаются в холодной ловушке и встроенных фильтрах HEPA. Обычно используется давление 100-150 мТорр. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Сушка и подготовка бактериальных макроколоний. Оптические изображения образцов агара (А) до и (Б) после удаления влаги с помощью десикации и вакуумной сушки. (C) Матрица 1,5-диаминонафталина MALDI наносится на бактериальную совместную культуру после сушки с помощью роботизированного распылителя. (D) Неудачная сушка обычно приводит к растрескиванию и пузырению внутри агара, что делает его непригодным для дальнейшего анализа. Сокращения: DAN = 1,5-диаминонафталин; MALDI = матричная лазерная десорбция/ионизация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Роботизированное распыление матрицы MALDI на образцы агарозы. Изображения (A) опрыскивателя HTX M5 TM и (B) образцов агарозы, загруженных в роботизированный матричный распылитель для нанесения матрицы MALDI. Аббревиатура: MALDI = матричная лазерная десорбция/ионизация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Адаптер масс-спектрометра с загруженными образцами для анализа. Образцы агарозы с матричным покрытием загружаются в адаптер предметного стекла MTP для анализа MALDI. Реперные маркеры видны в виде черных знаков плюса («+»). Аббревиатура: MALDI = матричная лазерная десорбция/ионизация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Репрезентативные масс-спектры идентифицированных пиков метаболит-ионов. (A) Отрицательный ионный режим Анализ образцов бактериальных культур MALDI позволяет обнаружить десятки метаболитов. Точные измерения массы с высоким разрешением позволяют предварительно идентифицировать (B) орнитин при m/z 131,083 (погрешность массы 0,34 ppm) и (C) аргинин при m/z 173,104 (погрешность массы 0,43 ppm). Масс-спектры получены с использованием разрешающей способности по массе (FWHM) 75 000 при m/z 150. Сокращения: MALDI = матричная лазерная десорбция/ионизация; FWHM = полная ширина при половине максимума. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Визуализационный масс-спектрометрический анализ бактериальных макроколоний. (А,С) На оптических изображениях образцов агарозы показаны области измерения для масс-спектрометрического анализа изображений, которые выделены белыми пунктирными линиями. (Б,Г) Ионные изображения MALDI для орнитина (m/z 131,083, 0,038 ppm) и аргинина (m/z 173,104, 0,60 ppm) показывают уникальное пространственное распределение по бактериальным культурам. Обратите внимание, что шкалы абсолютной интенсивности различаются для изображений ионов совместной культуры, показанных на панелях B и D. Например, аргинин значительно более распространен в монокультуре C. difficile по сравнению с кокультурой в панелях C и D, что означает, что эта шкала интенсивности связана с содержанием аргинина в монокультуре, и, по-видимому, в этой совместной культуре нет аргинина. И наоборот, совместная культура в А и В проецирует интенсивность аргинина на более низкую абсолютную шкалу интенсивности, поскольку это единственный образец на изображении. Сокращения: MALDI = матричная лазерная десорбция/ионизация; CASI = непрерывное накопление выбранных ионов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Визуализационный масс-спектрометрический анализ инфицированных тканей слепой кишки мышей. (A) Микроскопические изображения окрашенных гематоксилином и эозином тканей инфицированной мышиной слепой кишки позволяют визуализировать морфологию тканей. (B) Оптические изображения тканей слепой кишки мыши показывают образцы после нанесения матричного слоя DAN MALDI. (C) Ионные изображения MALDI для орнитина (m/z 131,083, 0,88 ppm) и аргинина (m/z 173,104, 0,15 ppm) демонстрируют уникальное пространственное распределение по образцам тканей. Сокращения: MALDI = матричная лазерная десорбция/ионизация; DAN = 1,5-диаминонафталин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Во время масс-спектрометрии визуализации MALDI важно иметь плоскую поверхность образца, чтобы обеспечить постоянный фокусный диаметр падающего лазера MALDI на подложке образца. Отклонения в высоте образца могут привести к смещению лазерного луча MALDI из фокуса, что приведет к изменению диаметра и интенсивности луча, что может повлиять на эффективность ионизации MALDI. Эти изменения в эффективности ионизации могут привести к различиям в интенсивности анализа по всей поверхности ткани, которые не отражают биохимию основной ткани, а вместо этого отражают топографию поверхности. Кроме того, большинство источников ионизации MALDI работают при субатмосферном давлении, а образцы гидратированного агара являются хрупкими образцами при воздействии в условиях вакуума . Вакуум этих источников может вызвать обезвоживание образцов агарозы, что может изменить поверхность образца во время сушки. Образцы, содержащие воздушные карманы или большое количество воды, очень восприимчивы к этим изменениям. Эта проблема обычно возникает во время масс-спектрометрического анализа бактериальных образцов, выращенных на агаре. Питательный агар имеет высокое содержание воды для облегчения роста бактерий; однако важно удалить как можно больше влаги перед нанесением матричного покрытия MALDI и введением образца в вакуум масс-спектрометра.

Таким образом, образцы гидратированного агара не подходят для вакуумного анализа. В дополнение к морфологическим изменениям, вызванным условиями вакуума , существуют также потенциальные проблемы, связанные с высотой образца, которая выступает слишком далеко от адаптера предметного стекла целевой пластины MALDI, который используется для удержания образца, установленного на предметном стекле микроскопа, и приведения его в правильное положение для фокусной точки лазера MALDI. Механизм ступени MALDI плотно связан с другими механическими компонентами ступени, и во время нахождения в нужном положении зазор между поверхностью целевой пластины образца и передним концом оптики источника ионов составляет всего несколько миллиметров. Это может привести к соскаблению образца, которое может сдвинуть или полностью сдвинуть анализируемый образец. Более того, в то время как образцы гидратированного агара естественным образом прилипают к поверхности предметного стекла микроскопа, это, как правило, намного слабее, чем прилипание полностью высушенного образца агара. Таким образом, образцы гидратированного агара выступают дальше от поверхности пластины-мишени для образца и имеют более слабую адгезию, что вызывает больший риск демонтажа образца и отслаивания в ионную оптику прибора, расположенную ниже по потоку.

Идентичность матрицы MALDI и выбор метода нанесения также являются важными переменными, которые следует учитывать в эксперименте по масс-спектрометрии изображения. Выбор органической матрицы MALDI в значительной степени зависит от образца, субстрата и целевых соединений, представляющих интерес. Например, многие низкомолекулярные метаболиты (MW < 300 Da) состоят из многих органических кислот, фосфатов и других фрагментов, которые легче ионизируются в отрицательной полярности28. Для анализа отрицательной моды предпочтительны основные матрицы, так что их химическая структура более поддается принятию протона (например, 9-аминоакридин, 1,5-диаминонафталин), поэтому оставляет отрицательный заряд на многих интересующих ионах малых метаболитов. Мы провели матричный скрининг для интересующих целевых аналитов и обнаружили, что матрица 1,5-диаминонафалина (DAN) дает самый высокий сигнал для аминокислотных метаболитов, представляющих интерес для контрольных образцов тканей. Во время нанесения матрицы MALDI интересующие аналиты извлекаются из подложки образца и совместно кристаллизуются с матрицей MALDI. В некоторых случаях «более влажные» условия применения матрицы будут способствовать увеличению экстракции и сокристаллизации, что приведет к улучшению обнаружения аналита при анализе MALDI. Однако, если в процессе нанесения матрицы используется слишком много растворителя, аналиты могут быть делокализованы в ткани. При выборе условий нанесения матрицы важно соблюдать баланс между эффективной экстракцией аналита и поддержанием пространственной точности аналитов в ткани. Например, изготовленный по индивидуальному заказу сублимационный аппарат может быть использован для нанесения однородного матричного слоя на поверхности образцов и получения чрезвычайно малых размеров кристаллов матрицы29,30. Однако этот процесс является достаточно сухим и может быть не оптимальным для экстракциианалита 31. Используемый здесь роботизированный распылитель обеспечивает воспроизводимый и точный контроль давления распыления, расхода, температуры сопла и других параметров, что позволяет оптимизировать методы экстракции аналита и сокристаллизации матрицы32.

Инструментальные параметры FTICR MS, используемые здесь, были оптимизированы для передачи и обнаружения ионов метаболитов в режиме отрицательных ионов. Это включает в себя настройку ВЧ- и DC-элементов в области переноса ионов для предпочтительной передачи ионов с низкой молекулярной массой (<m/z 200). Параметры, которые оказывают большое влияние на ионную передачу, включают амплитуду воронки RF (65 В), настройку массы Q1 для изоляции ионов квадрупольного массового фильтра (m/z 150) и задержку пролета между ячейкой накопления гексаполя и ячейкой ICR (0,400 мс). Эти выбранные значения параметров более эффективно пропускают ионы низких значений m/z за счет эффективности пропускания ионов больших значений m/z. Кроме того, мы использовали подход непрерывного накопления выбранных ионов (CASI), который позволяет селективно обогащать ионы в определенном окне массы, представляющем интерес. В этом подходе квадрупольный массовый фильтр используется для селективной передачи небольшого диапазона значений m/z от источника ионизации к ячейке накопления гексаполя в приборе, в то время как ионы со значениями m/z за пределами этого массового окна имеют нестабильные ионные траектории и не проходят через квадрупольный массовый фильтр. Это позволяет селективно обогащать малораспространенные аналиты, представляющие интерес, для улучшения предела обнаружения и динамического диапазона до трех порядков за счет устранения химического шума. Высокая разрешающая способность по массе и массовая точность приборной платформы FTICR позволяют легко разделять изобарические (т.е. с одинаковой номинальной массой) соединения и предварительно идентифицировать метаболиты.

Тщательный и воспроизводимый контроль пробоподготовки, применение матрицы MALDI и масс-спектрометрический анализ изображений могут обеспечить воспроизводимые представления о биохимии бактерий в колониях и образцах тканей. Бактериальные макроколонии служат упрощенными моделями для характеристики метаболической перекрестной коммуникации патогенов во время микробной инфекции, которую затем можно сравнить с более сложными системами, такими как ткани животных. Например, было обнаружено, что аргинин слабо распространен в образце совместной культуры C. difficile + E. faecalis по сравнению с одной только культурой C. difficile (рис. 6), что подтверждается отмеченной способностью E. faecalis потреблять аргинин в качестве источника энергии и экспортировать орнитин из клетки через антипортерArcD 33. Результаты макроколонии привели к исследованию этой регуляции аминокислот на животной модели. Мыши, инфицированные C. difficile + E. faecalis (wt), показали значительно меньше аргинина, чем мыши, инфицированные только C. difficile (рис. 7C), резюмируя результаты изображения колонии.

Чтобы проверить гипотезу о метаболизме аргинина и участии антипортера ArcD, мы использовали мутант транспозона, который выбивает транспорт метаболитов через антипортер ArcD E. faecalis. Мыши, инфицированные C. difficile + E. faecalis (arcD::Tn), демонстрируют увеличение обнаружения аргинина и снижение обнаружения орнитина по сравнению с моделью коинфекции дикого типа (рис. 7C) и в целом спасают исходные уровни аминокислот, наблюдаемые только в модели инфекции C. difficile (рис. 7A). Эта обратная зависимость регуляции метаболитов подтверждает выводы о том, что E. faecalis перекрестно питается аминокислотными питательными веществами, продуцируемыми из C. difficile. Кроме того, гистологический анализ показал обширное повреждение клеток у мышей, инфицированных как C. difficile, так и E. faecalis, что в первую очередь наблюдается у штамма дикого типа E. faecalis, противоположного мутанту транспозона ArcD. Эти результаты подтверждают наши недавние выводы о том, что аргинин и орнитин являются ключом к вирулентности, поведению C. difficile и
Фитнес 27. В целом, этот рабочий процесс демонстрирует эффективный метод подготовки бактериальных макроколоний на основе агара для масс-спектрометрии визуализации MALDI и показывает, что эти системы могут служить полезными моделями для изучения микробного сотрудничества во время инфекции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения (NIH) и Национальным институтом общих медицинских наук (NIGMS) под наградой GM138660. J.T.S. был поддержан семейной летней стипендией Чарльза и Моники Беркетт из Университета Флориды. J.P.Z. был поддержан грантами NIH K22AI7220 (NIAID) и R35GM138369 (NIGMS). A.B.S. был поддержан грантом на обучение клеточной и молекулярной биологии в Университете Пенсильвании (T32GM07229).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 μm Titan3 nylon syringe filters Thermo Scientific 42225-NN
1,5-diaminonaphthalene MALDI matrix Sigma Aldrich 2243-62-1
20 mL Henke Ject luer lock syringes Henke Sass Wolf 4200.000V0 
275i series convection vacuum gauge Kurt J. Lesker company KJL275807LL
7T solariX FTICR mass spectrometer equipped with a Smartbeam II Nd:YAG MALDI laser system (2 kHz, 355 nm)  Bruker Daltonics
Acetic acid solution, suitable for HPLC Sigma Aldrich 64-19-7
Acetonitrile, suitable for HPLC, gradient grade, ≥99.9% Sigma Aldrich 75-05-8
Ammonium hydroxide solution, 28% NH3 in H2O, ≥99.99% trace metals basis Sigma Aldrich 1336-21-6
Autoclavable biohazard bags: 55 gal Grainger 45TV10
Biohazard specimen transport bags (8 x 8 in.) Fisher Scientific 01-800-07
Brain heart infusion broth BD Biosciences 90003-040
C57BL/6 male mice  Jackson Laboratories
CanoScan 9000F Mark II photo and document scanner Canon
CM 3050S research cryomicrotome Leica Biosystems
Desiccator cabinet Sigma Aldrich Z268135
Diamond tip scriber, Electron Microscopy Sciences  Fisher Scientific 50-254-51
Drierite desiccant pellets Drierite 21005
Ethanol, 200 Proof Decon Labs 2701
flexImaging software Bruker Daltonics
ftmsControl software Bruker Daltonics
Glass vacuum trap Sigma Aldrich Z549460
HTX M5 TM robotic sprayer HTX Technologies
Indium Tin Oxide (ITO)-coated microscope slides Delta Technologies CG-81IN-S115
In-line HEPA filter to vacuum pump LABCONCO 7386500
Methanol, HPLC Grade Fisher Chemical   67-56-1
MTP slide-adapter II Bruker Daltonics 235380
Optimal cutting temperature (OCT) compound Fischer Scientific 23-730-571
Peridox RTU Sporicide, Disinfectant and Cleaner CONTEC CR85335 
PTFE (Teflon) printed slides, Electron Microscopy Sciences VWR 100488-874
Rotary vane vacuum pump RV8 Edwards A65401903
Tissue-Tek Accu-Edge Disposable High Profile Microtome Blades Electron Microscopy Sciences 63068-HP
Transparent vacuum tubing Cole Palmer EW-06414-30
Ultragrade 19 vacuum pump oil Edwards H11025011
Variable voltage transformer Powerstat
Water, suitable for HPLC Sigma Aldrich 7732-18-5
Wide-mouth dewar flask Sigma Aldrich Z120790

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Biteen, J. S., et al. Tools for the microbiome: nano and beyond. ACS Nano. 10 (1), 6-37 (2016).
  2. Shreiner, A. B., Kao, J. Y., Young, V. B. The gut microbiome in health and in disease. Current Opinion in Gastroenterology. 31 (1), 69-75 (2015).
  3. Watrous, J. D., Alexandrov, T., Dorrestein, P. C. The evolving field of imaging mass spectrometry and its impact on future biological research. Journal of Mass Spectrometry. 46 (2), 209-222 (2011).
  4. Gessel, M. M., Norris, J. L., Caprioli, R. M. MALDI imaging mass spectrometry: spatial molecular analysis to enable a new age of discovery. Journal of Proteomics. 107, 71-82 (2014).
  5. Fang, J., Dorrestein, P. C. Emerging mass spectrometry techniques for the direct analysis of microbial colonies. Current Opinion in Microbiology. 19, 120-129 (2014).
  6. Wheatcraft, D. R. A., Liu, X., Hummon, A. B. Sample preparation strategies for mass spectrometry imaging of 3D cell culture models. Journal of Visualized Experiments. (94), e52313 (2014).
  7. Zink, K. E., Dean, M., Burdette, J. E., Sanchez, L. M. Capturing small molecule communication between tissues and cells using imaging mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (146), e59490 (2019).
  8. Li, H., Hummon, A. B. Imaging mass spectrometry of three-dimensional cell culture systems. Analytical Chemistry. 83 (22), 8794-8801 (2011).
  9. Watrous, J. D., Dorrestein, P. C. Imaging mass spectrometry in microbiology. Nature Reviews Microbiology. 9 (9), 683-694 (2011).
  10. Dunham, S. J. B., Ellis, J. F., Li, B., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging of complex microbial communities. Accounts of Chemical Research. 50 (1), 96-104 (2017).
  11. Frydenlund Michelsen, C., et al. Evolution of metabolic divergence in Pseudomonas aeruginosa during long-term infection facilitates a proto-cooperative interspecies interaction. Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 10 (6), 1323-1336 (2016).
  12. Si, T., et al. Characterization of Bacillus subtilis colony biofilms via mass spectrometry and fluorescence imaging. Journal of Proteome Research. 15 (6), 1955-1962 (2016).
  13. Wakeman, C. A., et al. The innate immune protein calprotectin promotes Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus interaction. Nature Communications. 7, 11951 (2016).
  14. Phelan, V. V., Fang, J., Dorrestein, P. C. Mass spectrometry analysis of Pseudomonas aeruginosa treated with azithromycin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (6), 873-877 (2015).
  15. Ferreyra, J. A., et al. Gut microbiota-produced succinate promotes C. difficile infection after antibiotic treatment or motility disturbance. Cell Host & Microbe. 16 (6), 770-777 (2014).
  16. Buffie, C. G., et al. Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile. Nature. 517 (7533), 205-208 (2015).
  17. Schubert, A. M., et al. Microbiome data distinguish patients with Clostridium difficile infection and non-C. difficile-associated diarrhea from healthy controls. mBio. 5 (3), 01021-01014 (2014).
  18. Auchtung, J. M., et al. Identification of simplified microbial communities that inhibit Clostridioides difficile infection through dilution/extinction. mSphere. 5 (4), 00387 (2020).
  19. Zackular, J. P., et al. Dietary zinc alters the microbiota and decreases resistance to Clostridium difficile infection. Nature Medicine. 22 (11), 1330-1334 (2016).
  20. Tomkovich, S., Stough, J. M., Bishop, L., Schloss, P. D. The initial gut microbiota and response to antibiotic perturbation influence Clostridioides difficile clearance in mice. mSphere. 5 (5), 00869 (2020).
  21. Hoffmann, T., Dorrestein, P. C. Homogeneous matrix deposition on dried agar for MALDI imaging mass spectrometry of microbial cultures. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1959-1962 (2015).
  22. Yang, J. Y., et al. Primer on agar-based microbial imaging mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 194 (22), 6023-6028 (2012).
  23. Prentice, B. M., et al. Dynamic range expansion by gas-phase ion fractionation and enrichment for imaging mass spectrometry. Analytical Chemistry. 92 (19), 13092-13100 (2020).
  24. Bemis, K. D., et al. Cardinal: an R package for statistical analysis of mass spectrometry-based imaging experiments. Bioinformatics. 31 (14), 2418-2420 (2015).
  25. Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. A., Muddiman, D. C. MSiReader: An open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (5), 718-721 (2013).
  26. Bokhart, M. T., Nazari, M., Garrard, K. P., Muddiman, D. C. MSiReader v1.0: Evolving open-source mass spectrometry imaging software for targeted and untargeted analyses. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (1), 8-16 (2018).
  27. Smith, A. B., et al. Enterococci enhance Clostridioides difficile Pathogenesis. Nature. , (2022).
  28. Korte, A. R., Lee, Y. J. MALDI-MS analysis and imaging of small molecule metabolites with 1,5-diaminonaphthalene (DAN). Journal of Mass Spectrometry. 49 (8), 737-741 (2014).
  29. Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 18 (9), 1646-1652 (2007).
  30. Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: Enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition. Analytical Chemistry. 84 (4), 2048-2054 (2012).
  31. Huizing, L. R., et al. Development and evaluation of matrix application techniques for high throughput mass spectrometry imaging of tissues in the clinic. Clinical Mass Spectrometry. 12, 7-15 (2019).
  32. Anderton, C. R., Chu, R. K., Tolić, N., Creissen, A., Paša-Tolić, L. Utilizing a robotic sprayer for high lateral and mass resolution MALDI FT-ICR MSI of microbial cultures. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (3), 556-559 (2016).
  33. Gilmore, M. S., Clewell, D. B., Ike, Y., Shankar, N. Enterococci: From commensals to leading causes of drug resistant infection. Massachusetts Eye and Ear Infirmary. , Boston. (2014).

Tags

Биохимия выпуск 189
Исследование микробной кооперации <em>с помощью</em> визуализационного масс-спектрометрического анализа бактериальных колоний, выращенных на агаре и в тканях во время инфекции
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Specker, J. T., Smith, A. B.,… More

Specker, J. T., Smith, A. B., Keenan, O., Zackular, J. P., Prentice, B. M. Investigation of Microbial Cooperation via Imaging Mass Spectrometry Analysis of Bacterial Colonies Grown on Agar and in Tissue During Infection. J. Vis. Exp. (189), e64200, doi:10.3791/64200 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter