En Face Preparación del cojín endocárdico para el análisis de morfogénesis plana en embriones de ratón
Summary
Clásicamente, el endocardio del primordio de la válvula embrionaria de ratón se ha analizado utilizando secciones transversales, coronales o sagitales. Nuestro novedoso enfoque para imágenes bidimensionales en la cara del endocardio en regiones valvulogénicas permite el análisis de polaridad plana y reordenamiento celular del endocardio durante el desarrollo de la válvula.
Abstract
El estudio de los mecanismos celulares y moleculares subyacentes al desarrollo del corazón de los mamíferos es esencial para abordar la cardiopatía congénita humana. El desarrollo de las válvulas cardíacas primitivas implica la transición epitelial a mesenquimal (EMT) de las células endocárdicas del canal auriculoventricular (AVC) y las regiones del tracto de salida (OFT) del corazón en respuesta a las señales inductivas locales de miocardio y endocardio. Una vez que las células se deslaminan e invaden la matriz extracelular (jalea cardíaca) ubicada entre el endocardio y el miocardio, se forman los cojines endocárdicos primitivos (CE). Este proceso implica que el endocardio tiene que llenar los huecos dejados por las células deslaminadas y tiene que reorganizarse para converger (estrechar) o extenderse (alargarse) a lo largo de un eje. La investigación actual ha implicado la vía de polaridad de células planas (PCP) en la regulación de la localización subcelular de los factores involucrados en este proceso. Clásicamente, las fases iniciales del desarrollo de la válvula cardíaca se han estudiado en secciones transversales de corazones embrionarios o en explantes ex vivo AVC u OFT cultivados en geles de colágeno. Estos enfoques permiten el análisis de la polaridad apico-basal, pero no permiten el análisis del comportamiento celular dentro del plano del epitelio o de los cambios morfológicos de las células migratorias. Aquí, mostramos un enfoque experimental que permite la visualización del endocardio en regiones valvulogénicas como un campo plano de células. Este enfoque experimental brinda la oportunidad de estudiar PCP, topología plana y comunicación intercelular dentro del endocardio de OFT y AVC durante el desarrollo de la válvula. Descifrar nuevos mecanismos celulares implicados en la morfogénesis de la válvula cardíaca puede contribuir a comprender la cardiopatía congénita asociada con defectos del cojín endocárdico.
Introduction
El corazón es el primer órgano funcional de un embrión de mamífero. Alrededor del día embrionario (E) 7.5 en ratones, las células precardíacas bilaterales del mesodermo forman la media luna cardíaca en el lado ventral1. La media luna cardíaca contiene dos poblaciones de células precardíacas que incluyen progenitores del miocardio y el endocardio2. Alrededor de E8.0, los precursores cardíacos se fusionan en la línea media, formando el tubo cardíaco primitivo que consta de dos tejidos epiteliales, el miocardio externo y el endocardio interno, que es un endotelio especializado separado por una matriz extracelular llamada jalea cardíaca. Más tarde, en E8.5, el tubo cardíaco sufre un bucle hacia la derecha. El corazón en bucle tiene diferentes regiones anatómicas con firmas moleculares específicas, como el tracto de salida (OFT), los ventrículos y el canal atrio-ventricular (AVC)3. Aunque inicialmente el tubo cardíaco se expande en su lado de entrada a través de la adición de células4, en E9.5, la proliferación cardíaca intensiva resulta en el globo de las cámaras y el establecimiento de la red trabecular5. La formación de la válvula tiene lugar en la CVA (futuras válvulas mitral y tricúspide) y en la OFT (futuras válvulas aórtica y pulmonar).
El endocardio juega un papel crucial en el desarrollo de la válvula. Las células endocárdicas experimentan transición epitelial-mesenquimal (EMT) en el AVC y OFT para formar los cojines endocárdicos, una estructura que aparece al inicio del desarrollo de la válvula. Diferentes vías de señalización activan este proceso; en E9.5 en ratones, NOTCH activado en el endocardio en respuesta a BMP2 derivado del miocardio promueve la EMT invasiva de las células endocárdicas en las regiones AVC y OFT a través de la activación de TGFβ2 y SNAIL (SNAI1), que reprime directamente la expresión de cadherina endotelial vascular (VE-cadherina), un componente transmembrana de las uniones adherentes (AJs)6,7,8 . En la OFT, la activación del endocardio para iniciar la EMT está mediada por FGF8 y BMP4, cuya expresión es activada por NOTCH 9,10,11,12.
La progresión de la EMT implica la dinámica celular a medida que las células cambian de forma, rompen y rehacen las uniones con sus vecinas, se deslaminan y comienzan a migrar13. Estos cambios incluyen la remodelación de AJ y el desmontaje gradual 14,15, la señalización de polaridad celular plana (PCP), la pérdida de polaridad apicobasal (ABP), la constricción apical y la organización citoesquelética 16,17. ABP se refiere a la distribución de proteínas a lo largo del eje anterior-posterior de una célula. En el corazón en desarrollo, la regulación de la PBA en los cardiomiocitos es necesaria para el desarrollo ventricular18. PCP se refiere a una distribución polarizada de proteínas dentro de las células a través del plano de un tejido y regula la distribución celular; Los epitelios con una geometría estable están formados por células en forma de hexágono, donde solo tres células convergen en los vértices 19,20,21,22. Diferentes procesos celulares, como la división celular, el intercambio de vecinos o la delaminación que ocurre durante la morfogénesis epitelial, producen un aumento en el número de células que convergen en un vértice y el número de células vecinas que tiene una célula dada22. Estos comportamientos celulares relacionados con la PCP pueden ser regulados por diferentes vías de señalización, dinámica de actina o tráfico intracelular23.
Los datos generados estudiando el desarrollo de la válvula en ratones se han obtenido de secciones transversales, coronales o sagitales de corazones embrionarios E8.5 y E9.5, donde el endocardio se muestra como una línea de células en lugar de como un campo de células: el endocardio cubre toda la superficie interna del tubo cardíaco24. Las secciones embrionarias no permiten el análisis de PCP en el endocardio de embriones de ratón. Nuestro novedoso método experimental permite el análisis de la distribución celular endocárdica, la anisotropía AJ y el análisis de la forma de una sola célula, como se muestra en los resultados representativos. Este tipo de datos son necesarios para el análisis de PCP, junto con la descripción de otras moléculas relacionadas con PCP, que no se muestran en este informe. La inmunofluorescencia de montaje completo, la preparación específica de muestras y el uso de ratones modificados genéticamente permiten el análisis de polaridad plana en el endocardio al inicio del desarrollo de la válvula en ratones.
Protocol
Representative Results
Discussion
El endocardio es una monocapa epitelial que cubre toda la superficie interna del tubo cardíaco embrionario. Durante el desarrollo de la válvula, las células endocárdicas en las regiones valvulares prospectivas se someten a EMT, por lo que las células endocárdicas transforman y reorganizan su citoesqueleto para deslaminarse desde el endocardio hacia la jalea cardíaca. Nosotros y otros hemos obtenido datos relevantes sobre el desarrollo valvular en embriones de ratón mediante el análisis de secciones transversales…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por las subvenciones PID2019-104776RB-I00 y CB16/11/00399 (CIBER CV) de MCIN/AEI/10.13039/501100011033 a J. L. P. J.G.-B. fue financiado por el Programa de Atracción de Talento de la Comunidad de Madrid (2020-5ª/BMD-19729). T.G.-C. fue financiado por Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054). Agradecemos a la Unidad de Microscopía e Imagen Dinámica del CNIC, CNIC, ICTS-ReDib, cofinanciado por MCIN/AEI/10.13039/501100011033 y FEDER “A way to make Europe” (#ICTS-2018-04-CNIC-16). También agradecemos a A. Galicia y L. Méndez por la cría de ratones. El coste de esta publicación fue financiado en parte por fondos del Fondo Europeo de Desarrollo Regional. El CNIC cuenta con el apoyo del ISCIII, el MCIN y la Fundación Pro CNIC y es un Centro de Excelencia Severo Ochoa (subvención CEX2020-001041-S) financiado por MCIN/AEI/10.13039/501100011033.
Materials
| 4-OH-Tamoxifen | Sigma Aldrich | H-6278 | |
| 16 % Paraformaldheyde | Electron Microscopy Sciences | 157-10 | Dilute to 4% in water |
| anti-GFP | Aves Labs | FGP-1010 | |
| anti-VECadherin | BD Biosciences | 555289 | |
| Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11039 | |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 115-605-174 | |
| DAPI | AppliChem | A4099,0005 | |
| Slides Superfrost PLUS | VWR | 631-0108 | 25 mm x 75 mm x 1.0 mm |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Tween 20 | A4974,0500 | AppliChem | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 |
Riferimenti
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbour Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750 (2014).
- Ivanovitch, K., et al. outflow tract heart progenitors arise from spatially and molecularly distinct regions of the primitive streak. PLoS Biology. 19 (5), 3001200 (2021).
- Rochais, F., Mesbah, K., Kelly, R. G. Signaling pathways controlling second heart field development. Circulation Research. 104 (8), 933-942 (2009).
- Moorman, A. F., Christoffels, V. M. Cardiac chamber formation: Development, genes, and evolution. Physiological Reviews. 83 (4), 1223-1267 (2003).
- Timmerman, L. A., et al. Notch promotes epithelial-mesenchymal transition during cardiac development and oncogenic transformation. Genes & Development. 18 (1), 99-115 (2004).
- Luna-Zurita, L., et al. Integration of a Notch-dependent mesenchymal gene program and Bmp2-driven cell invasiveness regulates murine cardiac valve formation. Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3493-3507 (2010).
- Papoutsi, T., Luna-Zurita, L., Prados, B., Zaffran, S., de la Pompa, J. L. Bmp2 and Notch cooperate to pattern the embryonic endocardium. Development. 145 (13), (2018).
- MacGrogan, D., Luna-Zurita, L., de la Pompa, J. L. Notch signaling in cardiac valve development and disease. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 91 (6), 449-459 (2011).
- de la Pompa, J. L., Epstein, J. A. Coordinating tissue interactions: Notch signaling in cardiac development and disease. Developmental Cell. 22 (2), 244-254 (2012).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Developmental Cell. 95 (1), 108-114 (1983).
- Wu, B., et al. Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation. Circulation Research. 109 (2), 183-192 (2011).
- Amack, J. D. Cellular dynamics of EMT: Lessons from live in vivo imaging of embryonic development. Cell Communication and Signaling. 19 (1), 79 (2021).
- Cano, A., et al. The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression. Nature Cell Biology. 2 (2), 76-83 (2000).
- Batlle, E., et al. The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells. Nature Cell Biology. 2 (2), 84-89 (2000).
- Weng, M., Wieschaus, E. Myosin-dependent remodeling of adherens junctions protects junctions from Snail-dependent disassembly. Journal of Cell Biology. 212 (2), 219-229 (2016).
- Weng, M., Wieschaus, E. Polarity protein Par3/Bazooka follows myosin-dependent junction repositioning. Biologia dello sviluppo. 422 (2), 125-134 (2017).
- Jimenez-Amilburu, V., et al. In vivo visualization of cardiomyocyte apicobasal polarity reveals epithelial to mesenchymal-like transition during cardiac trabeculation. Cell Reports. 17 (10), 2687-2699 (2016).
- Davey, C. F., Moens, C. B. Planar cell polarity in moving cells: Think globally, act locally. Development. 144 (2), 187-200 (2017).
- Grego-Bessa, J., et al. The tumor suppressor PTEN and the PDK1 kinase regulate formation of the columnar neural epithelium. Elife. 5, 12034 (2016).
- Jones, C., Chen, P. Planar cell polarity signaling in vertebrates. Bioessays. 29 (2), 120-132 (2007).
- Mahaffey, J. P., Grego-Bessa, J., Liem, K. F., Anderson, K. V. Cofilin and Vangl2 cooperate in the initiation of planar cell polarity in the mouse embryo. Development. 140 (6), 1262-1271 (2013).
- Devenport, D. Tissue morphodynamics: Translating planar polarity cues into polarized cell behaviors. Seminars in Cell and Developmental Biology. 55, 99-110 (2016).
- Del Monte, G., Grego-Bessa, J., Gonzalez-Rajal, A., Bolos, V., De La Pompa, J. L. Monitoring Notch1 activity in development: Evidence for a feedback regulatory loop. Developmental Dynamics. 236 (9), 2594-2614 (2007).
- Xiao, C., Nitsche, F., Bazzi, H. Visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence. Journal of Visualized Experiments. (141), e58321 (2018).
- Mahler, G., Gould, R., Butcher, J. Isolation and culture of avian embryonic valvular progenitor cells. Journal of Visualized Experiments. (44), e2159 (2010).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Wang, Y., et al. Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis. Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).
- Yilmaz, M., Christofori, G. EMT, the cytoskeleton, and cancer cell invasion. Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 15-33 (2009).
- Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure. Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).
- Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis. Developmental Cell. 11 (4), 459-470 (2006).
- Prados, B., et al. Myocardial Bmp2 gain causes ectopic EMT and promotes cardiomyocyte proliferation and immaturity. Cell Death and Disease. 9 (3), 399 (2018).
- Camenisch, T. D., Biesterfeldt, J., Brehm-Gibson, T., Bradley, J., McDonald, J. A. Regulation of cardiac cushion development by hyaluronan. Experimental & Clinical Cardiology. 6 (1), 4-10 (2001).
- Courchaine, K., Rykiel, G., Rugonyi, S. Influence of blood flow on cardiac development. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 137, 95-110 (2018).
- Goddard, L. M., et al. Hemodynamic forces sculpt developing heart valves through a KLF2-WNT9B paracrine signaling axis. Developmental Cell. 43 (3), 274-289 (2017).
