En Face Preparação de Almofadas Endocárdicas para Análise de Morfogênese Planar em Embriões de Camundongos
Summary
Classicamente, o endocárdio do primordium da válvula embrionária de camundongo foi analisado usando cortes transversais, coronais ou sagitais. Nossa nova abordagem para imagens bidimensionais en face do endocárdio em regiões valvulogênicas permite a polaridade planar e a análise de rearranjo celular do endocárdio durante o desenvolvimento valvar.
Abstract
O estudo dos mecanismos celulares e moleculares subjacentes ao desenvolvimento do coração de mamíferos é essencial para tratar a doença cardíaca congênita humana. O desenvolvimento das valvas cardíacas primitivas envolve a transição epitelial-mesenquimal (EMT) de células endocárdicas das regiões do canal atrioventricular (CVA) e da via de saída (OFT) do coração em resposta a sinais miocárdicos e endocárdicos indutivos locais. Uma vez que as células se delaminam e invadem a matriz extracelular (geleia cardíaca) localizada entre o endocárdio e o miocárdio, formam-se as almofadas endocárdicas primitivas (CE). Este processo implica que o endocárdio tem que preencher as lacunas deixadas pelas células delaminadas e tem que se reorganizar para convergir (estreitar) ou estender (alongar) ao longo de um eixo. Pesquisas atuais implicaram a via da polaridade das células planares (PCP) na regulação da localização subcelular dos fatores envolvidos nesse processo. Classicamente, as fases iniciais do desenvolvimento da valva cardíaca têm sido estudadas em cortes transversais de corações embrionários ou em explantes ex vivo de AVC ou OFT cultivados em géis de colágeno. Essas abordagens permitem a análise da polaridade apico-basal, mas não permitem a análise do comportamento celular dentro do plano do epitélio ou das alterações morfológicas das células migratórias. Aqui, mostramos uma abordagem experimental que permite a visualização do endocárdio em regiões valvulogênicas como um campo planar de células. Esta abordagem experimental oferece a oportunidade de estudar PCP, topologia planar e comunicação intercelular dentro do endocárdio do OFT e AVC durante o desenvolvimento da válvula. Decifrar novos mecanismos celulares envolvidos na morfogênese valvar cardíaca pode contribuir para a compreensão da cardiopatia congênita associada a defeitos da almofada endocárdica.
Introduction
O coração é o primeiro órgão funcional de um embrião de mamíferos. Por volta do dia embrionário (E) 7,5 em camundongos, células mesodérmicas pré-cardíacas bilaterais formam o crescente cardíaco no lado ventral1. O crescente cardíaco contém duas populações de células pré-cardíacas que incluem progenitores do miocárdio e do endocárdio2. Por volta de E8.0, os precursores cardíacos se fundem na linha média, formando o tubo cardíaco primitivo composto por dois tecidos epiteliais, o miocárdio externo e o endocárdio interno, que é um endotélio especializado separado por uma matriz extracelular chamada geleia cardíaca. Mais tarde, em E8.5, o tubo cardíaco sofre looping para a direita. O coração em alça possui diferentes regiões anatômicas com assinaturas moleculares específicas, como a via de saída (OFT), os ventrículos e o canal atrioventricular (AVC)3. Embora inicialmente o tubo cardíaco se expanda em seu lado de entrada através da adição de células4, em E9,5, a proliferação cardíaca intensiva resulta em balonamento das câmaras e estabelecimento da rede trabecular5. A formação valvar ocorre no AVC (futuras valvas mitral e tricúspide) e no OFT (futuras valvas aórtica e pulmonar).
O endocárdio desempenha papéis cruciais no desenvolvimento da válvula. As células endocárdicas sofrem transição epitelial-mesenquimal (EMT) no AVC e no OFT para formar as almofadas endocárdicas, uma estrutura que aparece no início do desenvolvimento valvar. Diferentes vias de sinalização ativam esse processo; em E9.5 em camundongos, o NOTCH ativado no endocárdio em resposta à BMP2 derivada do miocárdio promove EMT invasiva de células endocárdicas nas regiões AVC e OFT por meio da ativação de TGFβ2 e SNAIL (SNAI1), que reprime diretamente a expressão da caderina endotelial vascular (VE-caderina), um componente transmembrana das junções aderentes (AJs)6,7,8 . No OFT, a ativação do endocárdio para iniciar a EMT é mediada pelo FGF8 e BMP4, cuja expressão é ativada pelo NOTCH 9,10,11,12.
A progressão da EMT envolve a dinâmica celular à medida que as células mudam de forma, quebram e refazem junções com seus vizinhos, delaminam e começam a migrar13. Essas alterações incluem remodelamento e desmontagem gradual de AJ 14,15, sinalização de polaridade celular planar (PCP), perda de polaridade ápico-basal (PAB), constrição apical e organização citoesquelética 16,17. ABP refere-se à distribuição de proteínas ao longo do eixo anteroposterior de uma célula. No coração em desenvolvimento, a regulação da PA em cardiomiócitos é necessária para o desenvolvimento ventricular18. PCP refere-se a uma distribuição polarizada de proteínas dentro das células através do plano de um tecido e regula a distribuição celular; epitélios com geometria estável são constituídos por células em forma de hexágono, onde apenas três células convergem nos vértices 19,20,21,22. Diferentes processos celulares, como divisão celular, troca de vizinhos ou delaminação que ocorrem durante a morfogênese epitelial, produzem um aumento no número de células que convergem para um vértice e no número de células vizinhas que uma determinada célula tem22. Esses comportamentos celulares relacionados à PCP podem ser regulados por diferentes vias de sinalização, dinâmica da actina ou tráfico intracelular23.
Os dados gerados que estudam o desenvolvimento valvar em camundongos foram obtidos de cortes transversais, coronais ou sagitais de corações embrionários E8.5 e E9.5, onde o endocárdio é mostrado como uma linha de células em vez de como um campo de células – o endocárdio cobre toda a superfície interna do tubo cardíaco24. Cortes embrionários não permitem a análise de PCP no endocárdio de embriões de camundongos. Nosso novo método experimental permite a análise da distribuição de células endocárdicas, anisotropia AJ e análise da forma de célula única, como mostrado nos resultados representativos. Este tipo de dados é necessário para a análise de PCP, juntamente com a descrição de outras moléculas relacionadas com PCP, não mostradas neste relatório. A imunofluorescência total, o preparo específico de amostras e o uso de camundongos geneticamente modificados permitem a análise de polaridade planar no endocárdio no início do desenvolvimento valvar em camundongos.
Protocol
Representative Results
Discussion
O endocárdio é uma monocamada epitelial que cobre toda a superfície interna do tubo cardíaco embrionário. Durante o desenvolvimento valvar, as células endocárdicas nas regiões valvares prospectivas sofrem EMT, assim, as células endocárdicas se transformam e reorganizam seu citoesqueleto para delaminar do endocárdio em direção à geleia cardíaca. Nós e outros obtivemos dados relevantes sobre o desenvolvimento valvar em embriões de camundongos analisando cortes transversais de corações embrionários E8.5 …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pelas bolsas PID2019-104776RB-I00 e CB16/11/00399 (CIBER CV) de MCIN/AEI/10.13039/501100011033 para J. L. P. J.G.-B. foi financiado pelo Programa de Atracción de Talento da Comunidade de Madrid (2020-5ª/BMD-19729). T.G.-C. foi financiado pela Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054). Agradecemos à Unidade CNIC de Microscopia e Imagem Dinâmica, CNIC, ICTS-ReDib, cofinanciada pelo MCIN/AEI/10.13039/501100011033 e FEDER “A way to make Europe” (#ICTS-2018-04-CNIC-16). Agradecemos também a A. Galicia e L. Méndez pela criação de ratos. O custo desta publicação foi parcialmente suportado por fundos do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional. O CNIC é apoiado pelo ISCIII, pelo MCIN e pela Fundação Pro CNIC e é um Centro de Excelência Severo Ochoa (bolsa CEX2020-001041-S) financiado pelo MCIN/AEI /10.13039/501100011033.
Materials
| 4-OH-Tamoxifen | Sigma Aldrich | H-6278 | |
| 16 % Paraformaldheyde | Electron Microscopy Sciences | 157-10 | Dilute to 4% in water |
| anti-GFP | Aves Labs | FGP-1010 | |
| anti-VECadherin | BD Biosciences | 555289 | |
| Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11039 | |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 115-605-174 | |
| DAPI | AppliChem | A4099,0005 | |
| Slides Superfrost PLUS | VWR | 631-0108 | 25 mm x 75 mm x 1.0 mm |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Tween 20 | A4974,0500 | AppliChem | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 |
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