تعديلات دقيقة بوساطة CRISPR-Cas9 في قلوب الزرد
Summary
يصف هذا البروتوكول نهجا لتسهيل التعديلات الدقيقة في أجنة الزرد باستخدام تقنية CRISPR-Cas9. يتم تقديم خط أنابيب التنميط الظاهري لإثبات قابلية تطبيق هذه التقنيات لنمذجة متغير جيني مرتبط بمتلازمة فترة QT الطويلة.
Abstract
تتيح التكرارات العنقودية القصيرة المتباعدة بانتظام (CRISPR) في النماذج الحيوانية التلاعب الجيني الدقيق لدراسة الظواهر الفسيولوجية. تم استخدام الزرد كنموذج وراثي فعال لدراسة العديد من الأسئلة المتعلقة بالأمراض الوراثية والتطور وعلم السموم على مستوى الأعضاء والكائنات الحية بأكملها. نظرا لجينوم سمك الزرد المشروح جيدا والمعين ، تم تطوير العديد من الأدوات لتحرير الجينات. ومع ذلك ، فإن فعالية توليد وسهولة اكتشاف التعديلات الدقيقة باستخدام كريسبر هي عامل مقيد. يوصف هنا نهج قائم على CRISPR-Cas9 مع الكشف البسيط عن التعديلات الدقيقة في الجين المسؤول عن إعادة استقطاب القلب والمرتبط بالاضطراب الكهربائي ، متلازمة فترة QT الطويلة (LQTS). هذا النهج ثنائي الدليل RNA (sgRNA) يستأصل ويحل محل التسلسل المستهدف ويربط جين مراسل مشفر وراثيا. يتم توضيح فائدة هذا النهج من خلال وصف قياسات النمط الظاهري غير الغازية للوظيفة الكهربائية للقلب في يرقات الزرد من النوع البري والمحرر جينيا. يتيح هذا النهج الدراسة الفعالة للمتغيرات المرتبطة بالمرض في كائن حي بأكمله. علاوة على ذلك ، توفر هذه الاستراتيجية إمكانيات لإدخال تسلسلات خارجية من الاختيار ، مثل جينات المراسل ، أو تقويم العظام ، أو محرري الجينات.
Introduction
تتيح استراتيجيات تحرير الجينات القائمة على كريسبر في النماذج الحيوانية دراسة الأمراض الوراثية وراثيا وتطورها وعلم السموم على مستوى الكائن الحي بأكمله1،2،3. يوفر الزرد نموذجا قويا أقرب في العديد من الجوانب الفسيولوجية للبشر من الفئران أو نماذج الخلايا المشتقة من الإنسان4. تم استخدام مجموعة واسعة من الأدوات والاستراتيجيات الجينية في الزرد لكل من الفحص الجيني الأمامي5 والعكسي6. سهلت الخرائط الجينية الشاملة والتعليقات التوضيحية في أسماك الزرد نهج تحرير الجينات كتقنية أولية لهندسة الضربات القاضية الجينية المستهدفة (KOs) والضربات الدقيقة (KIs)7.
على الرغم من ذلك ، فإن إنشاء تعديلات KI دقيقة في الزرد محدود بسبب الكفاءة المنخفضة وصعوبة الكشف الدقيق. على الرغم من أن نوكلياز المستجيب الشبيه بعامل النسخ (TALENs) قد تم استخدامه بنجاح وتحسينه ل KIs8 ، إلا أن CRISPR توفر استراتيجية محسنة لتحرير الجينات مع استهداف sgRNA أبسط. استخدمت العديد من الدراسات كريسبر لتوليد KIs دقيقة في أسماك الزرد9،10،11،12،13،14،15،16،17،18،19،20 ، على الرغم من أن هذه التعديلات التي تم إنشاؤها من خلال الإصلاح الموجه بالتماثل بوساطة كريسبر (HDR) تميل إلى أن تكون غير فعالة مع نجاح جوهري منخفض المعدلات التي تتطلب التنميط الجيني كشاشة أساسية9،10،14،21. يوضح هذا الحاجة إلى نظام KI CRISPR فعال في الزرد ، بالإضافة إلى نظام موثوق عالي الإنتاجية للكشف عن التعديلات الدقيقة.
كان الهدف من هذه الدراسة هو وصف منصة لتوليد جين قلبي دقيق KI في قلوب الزرد مع اكتشاف بسيط وعالي الإنتاجية للتعديلات الناجحة. تم وصف نهج استبدال إكسون ثنائي sgRNA قائم على CRISPR-Cas9 ، والذي يعتمد على نهج TALEN8. يتضمن هذا النهج استئصال التسلسل المستهدف باستخدام دليلين من sgRNA واستبداله بتسلسل قالب خارجي يحتوي على KI محل الاهتمام بالإضافة إلى جين مراسل intronic مشفر وراثيا (الشكل 1). يتيح دمج مراسل الفلورسنت المشفر وراثيا ضمن تسلسل الجين المستهدف الكشف الفعال عن التعديلات الإيجابية. ثم يتم وصف منصة التنميط الظاهري لتقييم الوظيفة الكهربائية للقلب في يرقات الزرد للتوصيف غير الجراحي للمتغيرات الجينية المرتبطة ب LQTS الموروثة ، وهو اضطراب كهربائي في القلب يهيئ الأفراد للموت القلبي المفاجئ.
ستعزز هذه الأساليب الوصول إلى تعديلات جينات KI لسمك الزرد واستخدامها لنمذجة الأمراض الوراثية ومعالجة الأسئلة البيولوجية والفسيولوجية ، مثل رسم خرائط أنماط التعبير الجيني ، والتنظيم التنموي. نظرا لأن قلوب الزرد توازي الخصائص الكهربية للقلب البشري بشكل أفضل من نماذج الفئران ، فقد تكون جذابة بشكل خاص كنظام قابل للتتبع وراثيا لنمذجة أمراض القلب7،22،23.
Protocol
Representative Results
Discussion
تواجه هندسة التعديلات الجينية الدقيقة باستخدام CRISPR-Cas9 تحديا بسبب الكفاءة المنخفضة لآليات HDR واكتشافها الفعال. هنا ، يتم وصف نهج استبدال إكسون ثنائي sgRNA قائم على CRISPR-Cas9 ينتج تعديلات دقيقة في الزرد مع اكتشاف مرئي مباشر للتعديلات الإيجابية. يتم إثبات فعالية هذا النهج من خلال توليد تعديلات دق?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا البحث من خلال منحة مشروع المعاهد الكندية للبحوث الصحية (T.W.C.) ومنح مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا ديسكفري (T.W.C.).
Materials
| Program | |||
| CRISPOR | TEFOR Infrastructure | ||
| ENSEMBL | European Bioinformatics Institute | ||
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | ||
| Micro-Manager | Open Source (Github) | ||
| NEBiocalculator | New England Biolabs (NEB) | ||
| EQUIPMENT | |||
| 24-well Plate | VWR | ||
| 25 mm Petri Dish | VWR | ||
| Blackfly USB3 Camera | Teledyne FLIR | ||
| C1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| Centrifuge 5415C | Eppendorf | ||
| EZNA Gel Extraction Kit | Omega Biotek | ||
| MAXIscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | ||
| MaxQ 5000 Incubator | Barnstead Lab Line | ||
| Miniprep Kit | Qiagen | ||
| mMessage mMachine T7 Ultra Transcription Kit | Invitrogen | ||
| ND1000 Spectrophotometer | Nanodrop | ||
| PCR Purification Kit | Qiagen | ||
| PLI 100A Picoinjector | Harvard Apparatus | ||
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | ||
| Stemi 305 Steroscope | Zeiss | ||
| Wide Mini Sub Cell GT Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| ZebTec Zebrafish Housing System | Tecniplast | ||
| SERVICES | |||
| Gene Synthesis | Genewiz | ||
| Sanger Sequencing | Genewiz | ||
| REAGENTS | |||
| 10β Competent Cells | NEB | ||
| 10X PCR Buffer | Qiagen | ||
| 100 mM Nucleotide Mixture | ABM | ||
| Ampicillin | Sigma | ||
| BamHI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| BsaI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| DR274 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
| EcoRI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Glycerol | |||
| HEPES | Sigma | ||
| HindIII Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Kanamycin | Sigma | ||
| Methylene Blue | Sigma | ||
| MLM3613 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
| MS-222 (Tricaine) | Sigma | ||
| pKHR5 Plasmid (DH5α bacterial agar stab) | Addgene | ||
| PmeI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| SalI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma | ||
| T4 Ligase w/ buffer | Sigma | ||
| Taq Polymerase | Qiagen | ||
| TE Buffer | Sigma | ||
| Tris Hydrochloride | Sigma | ||
| XhoI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| RECIPES | |||
| Solution | Component | Supplier | |
| Annealing Buffer (pH 7.5-8.0) | 10 mM Tris | Sigma | |
| 50 mM NaCl | Sigma | ||
| 1 mM EDTA | Sigma | ||
| E3 Media (pH 7.2) | 5 mM NaCl | Sigma | |
| 0.17 mM KCl | Sigma | ||
| 0.33 mM CaCl2 | Sigma | ||
| 0.33 mM MgSO4 | Sigma | ||
| Injection Buffer (pH 7.5) | 20 mM HEPES | Sigma | |
| 150 mM KCl | Sigma |
Riferimenti
- Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9. The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082 (2019).
- Lee, H., Yoon, D. E., Kim, K. Genome editing methods in animal models. Animal Cells and Systems. 24 (1), 8-16 (2020).
- Li, Q., et al. Applications of genome editing technology in animal disease modeling and gene therapy. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 689-698 (2019).
- Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. Little fish, big data: Zebrafish as a model for cardiovascular and metabolic disease. Physiological Reviews. 97 (3), 889-938 (2017).
- Kegel, L., et al. Forward genetic screen using zebrafish to identify new genes involved in myelination. Oligodendrocytes: Methods and Protocols. 1936, 185-209 (2019).
- Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
- González-Rosa, J. M. Zebrafish models of cardiac disease: From fortuitous mutants to precision medicine. Circulation Research. 130 (12), 1803-1826 (2022).
- Hoshijima, K., Jurynec, M. J., Grunwald, D. J. Precise editing of the Zebrafish genome made simple and efficient. Developmental Cell. 36 (6), 654-667 (2016).
- Albadri, S., Del Bene, F., Revenu, C. Genome editing using CRISPR/Cas9-based knock-in approaches in zebrafish. Methods. 121-122, 77-85 (2017).
- Armstrong, G. A. B., et al. Homology directed knockin of point mutations in the zebrafish tardbp and fus genes in ALS using the CRISPR/Cas9 system. PLoS One. 11 (3), 0150188 (2016).
- Bai, H., et al. CRISPR/Cas9-mediated precise genome modification by a long ssDNA template in zebrafish. BMC Genomics. 21 (1), 67 (2020).
- de Vrieze, E., et al. Efficient generation of knock-in zebrafish models for inherited disorders using CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9429 (2021).
- Eschstruth, A., Schneider-Maunoury, S., Giudicelli, F. Creation of zebrafish knock-in reporter lines in the nefma gene by Cas9-mediated homologous recombination. Genesis. 58 (1), 23340 (2020).
- Irion, U., Krauss, J., Nüsslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
- Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4 (1), 6545 (2014).
- Levic, D. S., Yamaguchi, N., Wang, S., Knaut, H., Bagnat, M. Knock-in tagging in zebrafish facilitated by insertion into non-coding regions. Development. 148 (19), (2021).
- Prykhozhij, S. V., et al. Optimized knock-in of point mutations in zebrafish using CRISPR/Cas9. Nucleic Acids Research. 46 (17), 102 (2018).
- Wierson, W. A., et al. Efficient targeted integration directed by short homology in zebrafish and mammalian cells. eLife. 9, 53968 (2020).
- Boel, A., et al. CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair by ssODNs in zebrafish induces complex mutational patterns resulting from genomic integration of repair-template fragments. Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Tessadori, F., et al. Effective CRISPR/Cas9-based nucleotide editing in zebrafish to model human genetic cardiovascular disorders. Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Zhang, Y., Zhang, Z., Ge, W. An efficient platform for generating somatic point mutations with germline transmission in the zebrafish by CRISPR/Cas9-mediated gene editing. The Journal of Biological Chemistry. 293 (17), 6611-6622 (2018).
- Vornanen, M., Hassinen, M. Zebrafish heart as a model for human cardiac electrophysiology. Channels. 10 (2), 101-110 (2016).
- Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).
- Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Precipitation of Large RNAs with Lithium Chloride. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 3. E.15. , (1989).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Agarose Gel Electrophoresis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 1. , 3-20 (1989).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Kossack, M. E., Draper, B. W. Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio). Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).
- Tanaka, Y., et al. Functional analysis of KCNH2 gene mutations of type 2 long QT syndrome in larval zebrafish using microscopy and electrocardiography. Heart and Vessels. 34 (1), 159-166 (2019).
- Dhillon, S. S., et al. Optimisation of embryonic and larval ECG measurement in zebrafish for quantifying the effect of QT prolonging drugs. PLoS One. 8 (4), 60552 (2013).
- Yu, F., et al. Evolving cardiac conduction phenotypes in developing zebrafish larvae: Implications to drug sensitivity. Zebrafish. 7 (4), 325-331 (2010).
- Hurst, R. M. . Development and optimization of tools for embryonic electrocardiograph recording for heart dysfunction in zebrafish. , (2018).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. BioTechniques. 43 (5), 610-614 (2007).
- Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11316-11321 (2007).
- Milan, D. J., Peterson, T. A., Ruskin, J. N., Peterson, R. T., MacRae, C. A. Drugs that induce repolarization abnormalities cause bradycardia in zebrafish. Circulation. 107 (10), 1355-1358 (2003).
- Langheinrich, U., Vacun, G., Wagner, T. Zebrafish embryos express an orthologue of HERG and are sensitive toward a range of QT-prolonging drugs inducing severe arrhythmia. Toxicology and Applied Pharmacology. 193 (3), 370-382 (2003).
- MacRae, C. A. Cardiac arrhythmia: In vivo screening in the zebrafish to overcome complexity in drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (7), 619-632 (2010).
