Denne protokollen beskriver en tilnærming for å legge til rette for presise knock-in-redigeringer i sebrafiskembryoer ved hjelp av CRISPR-Cas9-teknologi. En fenotypingspipeline presenteres for å demonstrere anvendeligheten av disse teknikkene for å modellere en Long QT Syndrome-assosiert genvariant.
Grupperte regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner (CRISPR) i dyremodeller muliggjør presis genetisk manipulasjon for studier av fysiologiske fenomener. Sebrafisk har blitt brukt som en effektiv genetisk modell for å studere en rekke spørsmål knyttet til arvelig sykdom, utvikling og toksikologi på hele organ- og organismenivå. På grunn av det godt kommenterte og kartlagte sebrafiskgenomet er det utviklet mange verktøy for genredigering. Imidlertid er effekten av å generere og enkelt å oppdage presise knock-in-redigeringer ved hjelp av CRISPR en begrensende faktor. Beskrevet her er en CRISPR-Cas9-basert knock-in tilnærming med enkel påvisning av presise redigeringer i et gen som er ansvarlig for hjerte-repolarisering og assosiert med den elektriske lidelsen, Long QT Syndrome (LQTS). Denne to-single-guide RNA (sgRNA) tilnærmingen excises og erstatter målsekvensen og kobler et genetisk kodet reportergen. Nytten av denne tilnærmingen er demonstrert ved å beskrive ikke-invasive fenotypiske målinger av hjertets elektriske funksjon i villtype og genredigerte sebrafisklarver. Denne tilnærmingen muliggjør effektiv studie av sykdomsassosierte varianter i en hel organisme. Videre gir denne strategien muligheter for innsetting av eksogene sekvenser av valg, for eksempel reportergener, ortologer eller genredaktører.
CRISPR-baserte genredigeringsstrategier i dyremodeller muliggjør studier av genetisk arvelig sykdom, utvikling og toksikologi på hele organismenivå 1,2,3. Sebrafisk gir en kraftig modell som er nærmere i mange fysiologiske aspekter til mennesker enn murine eller menneskeavledede cellemodeller4. Et omfattende utvalg av genetiske verktøy og strategier har blitt brukt i sebrafisk forbåde fremover 5 og omvendt genetisk screening6. Omfattende genetisk kartlegging og annotering i sebrafisk har gjort det lettere å redigere genredigeringsmetoder som en primær teknikk for å konstruere målrettede gen knockouts (KOs) og presise knock-ins (KIs)7.
Til tross for dette er generering av presise KI-redigeringer i sebrafisk begrenset av lav effektivitet og vanskeligheten med nøyaktig deteksjon. Selv om transkripsjonsfaktorlignende effektornukleaser (TALENs) har blitt brukt og optimalisert for KIs8, gir CRISPR en forbedret genredigeringsstrategi med enklere sgRNA-målretting. Tallrike studier har brukt CRISPR til å generere presise KIer i sebrafisk 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, selv om disse redigeringene generert gjennom CRISPR-mediert homologi-rettet reparasjon (HDR) har en tendens til å være ineffektive med lav iboende suksess priser som krever genotyping som primærskjerm 9,10,14,21. Dette viser behovet for et effektivt KI CRISPR-system i sebrafisk, samt et pålitelig system med høy gjennomstrømning for å oppdage presise redigeringer.
Målet med denne studien var å beskrive en plattform for å generere et presist hjertegen KI i sebrafiskhjerter med enkel og høy gjennomstrømningsdeteksjon av vellykkede redigeringer. En CRISPR-Cas9-basert to-sgRNA eksonutskiftningsmetode er beskrevet, som er basert på en TALEN-tilnærming8. Denne tilnærmingen innebærer eksisjon av målsekvensen ved hjelp av to-sgRNA-guider og erstatning med en eksogen malsekvens som inneholder KI av interesse, samt et genetisk kodet intronisk reportergen (figur 1). Integrasjonen av en genetisk kodet fluorescerende reporter i målgenets introniske sekvens muliggjør effektiv påvisning av positive redigeringer. Deretter beskrives en fenotypingsplattform for vurdering av hjertets elektriske funksjon hos sebrafisklarver for ikke-invasiv karakterisering av genvariantene assosiert med arvelig LQTS, en hjerteelektrisk lidelse som disponerer individer for plutselig hjertedød.
Disse tilnærmingene vil forbedre tilgangen til og bruken av sebrafisk KI-genredigeringer for å modellere arvelige sykdommer og adressere biologiske og fysiologiske spørsmål, for eksempel kartlegging av genuttrykksmønstre og utviklingsregulering. Siden sebrafiskhjerter bedre parallelle menneskelige hjerteelektrofysiologiske egenskaper enn murine modeller, kan de være spesielt attraktive som et genetisk trekkbart system for hjertesykdomsmodellering 7,22,23.
Prosjekteringen av presise genredigeringer ved hjelp av CRISPR-Cas9 utfordres av den lave effektiviteten til HDR-mekanismer og deres effektive deteksjon. Her beskrives en CRISPR-Cas9-basert to-sgRNA eksonutskiftningsmetode som gir presise redigeringer i sebrafisk med enkel visuell deteksjon av positive redigeringer. Effekten av denne tilnærmingen er demonstrert ved å generere presise redigeringer i zkcnh6a-genet . Denne artikkelen viser hvordan hjertefunksjonen hos genredigerte sebrafisklarver kan vurderes ved…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av et kanadisk institutt for helseforskningsprosjekt (TWC) og Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery grants (TWC).
Program | |||
CRISPOR | TEFOR Infrastructure | ||
ENSEMBL | European Bioinformatics Institute | ||
ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | ||
Micro-Manager | Open Source (Github) | ||
NEBiocalculator | New England Biolabs (NEB) | ||
EQUIPMENT | |||
24-well Plate | VWR | ||
25 mm Petri Dish | VWR | ||
Blackfly USB3 Camera | Teledyne FLIR | ||
C1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
Centrifuge 5415C | Eppendorf | ||
EZNA Gel Extraction Kit | Omega Biotek | ||
MAXIscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | ||
MaxQ 5000 Incubator | Barnstead Lab Line | ||
Miniprep Kit | Qiagen | ||
mMessage mMachine T7 Ultra Transcription Kit | Invitrogen | ||
ND1000 Spectrophotometer | Nanodrop | ||
PCR Purification Kit | Qiagen | ||
PLI 100A Picoinjector | Harvard Apparatus | ||
PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | ||
Stemi 305 Steroscope | Zeiss | ||
Wide Mini Sub Cell GT Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
ZebTec Zebrafish Housing System | Tecniplast | ||
SERVICES | |||
Gene Synthesis | Genewiz | ||
Sanger Sequencing | Genewiz | ||
REAGENTS | |||
10β Competent Cells | NEB | ||
10X PCR Buffer | Qiagen | ||
100 mM Nucleotide Mixture | ABM | ||
Ampicillin | Sigma | ||
BamHI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
BsaI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
DR274 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
EcoRI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
Glycerol | |||
HEPES | Sigma | ||
HindIII Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
Kanamycin | Sigma | ||
Methylene Blue | Sigma | ||
MLM3613 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
MS-222 (Tricaine) | Sigma | ||
pKHR5 Plasmid (DH5α bacterial agar stab) | Addgene | ||
PmeI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
SalI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
Sodium Hydroxide | Sigma | ||
T4 Ligase w/ buffer | Sigma | ||
Taq Polymerase | Qiagen | ||
TE Buffer | Sigma | ||
Tris Hydrochloride | Sigma | ||
XhoI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
RECIPES | |||
Solution | Component | Supplier | |
Annealing Buffer (pH 7.5-8.0) | 10 mM Tris | Sigma | |
50 mM NaCl | Sigma | ||
1 mM EDTA | Sigma | ||
E3 Media (pH 7.2) | 5 mM NaCl | Sigma | |
0.17 mM KCl | Sigma | ||
0.33 mM CaCl2 | Sigma | ||
0.33 mM MgSO4 | Sigma | ||
Injection Buffer (pH 7.5) | 20 mM HEPES | Sigma | |
150 mM KCl | Sigma |