Этот протокол описывает подход к облегчению точного внесения изменений в эмбрионы рыбок данио с использованием технологии CRISPR-Cas9. Представлен конвейер фенотипирования, чтобы продемонстрировать применимость этих методов для моделирования варианта гена, связанного с синдромом удлиненного интервала QT.
Кластеризованные регулярно чередующиеся короткие палиндромные повторы (CRISPR) на животных моделях позволяют проводить точные генетические манипуляции для изучения физиологических явлений. Рыбки данио использовались в качестве эффективной генетической модели для изучения многочисленных вопросов, связанных с наследственными заболеваниями, развитием и токсикологией на уровне всего органа и организма. Благодаря хорошо аннотированному и нанесенному на карту геному рыбки данио были разработаны многочисленные инструменты для редактирования генов. Тем не менее, эффективность генерации и простота обнаружения точных изменений с использованием CRISPR является ограничивающим фактором. Здесь описан подход на основе CRISPR-Cas9 с простым обнаружением точных изменений в гене, ответственном за реполяризацию сердца и связанном с электрическим расстройством, синдромом длинного QT (LQTS). Этот подход с двумя одноруковой РНК (sgRNA) иссекает и заменяет целевую последовательность и связывает генетически закодированный ген-репортер. Полезность этого подхода демонстрируется описанием неинвазивных фенотипических измерений электрической функции сердца у личинок рыбок данио дикого типа и генетически отредактированных. Такой подход позволяет эффективно изучать связанные с заболеванием варианты в целом организме. Кроме того, эта стратегия предлагает возможности для вставки экзогенных последовательностей по выбору, таких как репортерные гены, ортологи или редакторы генов.
Стратегии редактирования генов на основе CRISPR на животных моделях позволяют изучать генетически наследственные заболевания, развитие и токсикологию на уровне всего организма 1,2,3. Рыбки данио представляют собой мощную модель, которая ближе во многих физиологических аспектах к людям, чем мышиные или человеческие клеточные модели4. Обширный спектр генетических инструментов и стратегий был использован у рыбок данио как для прямого5, так и для обратного генетического скрининга6. Всестороннее генетическое картирование и аннотация рыбок данио облегчили подходы к редактированию генов в качестве основного метода для разработки целевых нокаутов генов (KOs) и точных нокаутов (KIs)7.
Несмотря на это, генерация точных изменений KI у рыбок данио ограничена низкой эффективностью и сложностью точного обнаружения. Хотя транскрипционные эффекторные нуклеазы (TALEN) были успешно использованы и оптимизированы для KIs8, CRISPR обеспечивает улучшенную стратегию редактирования генов с более простым таргетированием sgRNA. Многочисленные исследования использовали CRISPR для получения точных KIs у рыбок данио 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, хотя эти изменения, полученные с помощью CRISPR-опосредованного гомологического восстановления (HDR), как правило, неэффективны с низким внутренним успехом. показатели, требующие генотипирования в качестве основного экрана 9,10,14,21. Это демонстрирует необходимость эффективной системы KI CRISPR у рыбок данио, а также надежной высокопроизводительной системы для обнаружения точных правок.
Цель этого исследования состояла в том, чтобы описать платформу для генерации точного сердечного гена KI в сердцах рыбок данио с простым и высокопроизводительным обнаружением успешных правок. Описан подход замены экзонов на основе CRISPR-Cas9 с двумя сгРНК, который основан на подходеTALEN 8. Этот подход включает в себя иссечение целевой последовательности с использованием двух сгРНК-направляющих и замену экзогенной шаблонной последовательностью, содержащей интересующий КИ, а также генетически закодированный интронный ген-репортер (рисунок 1). Интеграция генетически закодированного флуоресцентного репортера в интронную последовательность гена-мишени позволяет эффективно обнаруживать положительные изменения. Затем описывается фенотипирующая платформа для оценки электрической функции сердца у личинок рыбок данио для неинвазивной характеристики вариантов генов, связанных с унаследованным LQTS, сердечным электрическим расстройством, которое предрасполагает людей к внезапной сердечной смерти.
Эти подходы расширят доступ и использование изменений генов KI рыбок данио для моделирования наследственных заболеваний и решения биологических и физиологических вопросов, таких как картирование паттернов экспрессии генов и регуляция развития. Поскольку сердца рыбок данио лучше соответствуют сердечным электрофизиологическим характеристикам человека, чем мышиные модели, они могут быть особенно привлекательными в качестве генетически трактуемой системы для моделирования сердечных заболеваний 7,22,23.
Разработка точных изменений генов с использованием CRISPR-Cas9 оспаривается низкой эффективностью механизмов HDR и их эффективным обнаружением. Здесь описан подход замены экзонов на основе CRISPR-Cas9 с двумя сгРНК, который производит точные изменения у рыбок данио с простым визуальным обнаруже…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было поддержано грантом Канадского исследовательского проекта Института здравоохранения (T.W.C.) и грантами Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады Discovery (T.W.C.).
Program | |||
CRISPOR | TEFOR Infrastructure | ||
ENSEMBL | European Bioinformatics Institute | ||
ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | ||
Micro-Manager | Open Source (Github) | ||
NEBiocalculator | New England Biolabs (NEB) | ||
EQUIPMENT | |||
24-well Plate | VWR | ||
25 mm Petri Dish | VWR | ||
Blackfly USB3 Camera | Teledyne FLIR | ||
C1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
Centrifuge 5415C | Eppendorf | ||
EZNA Gel Extraction Kit | Omega Biotek | ||
MAXIscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | ||
MaxQ 5000 Incubator | Barnstead Lab Line | ||
Miniprep Kit | Qiagen | ||
mMessage mMachine T7 Ultra Transcription Kit | Invitrogen | ||
ND1000 Spectrophotometer | Nanodrop | ||
PCR Purification Kit | Qiagen | ||
PLI 100A Picoinjector | Harvard Apparatus | ||
PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | ||
Stemi 305 Steroscope | Zeiss | ||
Wide Mini Sub Cell GT Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
ZebTec Zebrafish Housing System | Tecniplast | ||
SERVICES | |||
Gene Synthesis | Genewiz | ||
Sanger Sequencing | Genewiz | ||
REAGENTS | |||
10β Competent Cells | NEB | ||
10X PCR Buffer | Qiagen | ||
100 mM Nucleotide Mixture | ABM | ||
Ampicillin | Sigma | ||
BamHI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
BsaI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
DR274 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
EcoRI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
Glycerol | |||
HEPES | Sigma | ||
HindIII Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
Kanamycin | Sigma | ||
Methylene Blue | Sigma | ||
MLM3613 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
MS-222 (Tricaine) | Sigma | ||
pKHR5 Plasmid (DH5α bacterial agar stab) | Addgene | ||
PmeI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
SalI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
Sodium Hydroxide | Sigma | ||
T4 Ligase w/ buffer | Sigma | ||
Taq Polymerase | Qiagen | ||
TE Buffer | Sigma | ||
Tris Hydrochloride | Sigma | ||
XhoI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
RECIPES | |||
Solution | Component | Supplier | |
Annealing Buffer (pH 7.5-8.0) | 10 mM Tris | Sigma | |
50 mM NaCl | Sigma | ||
1 mM EDTA | Sigma | ||
E3 Media (pH 7.2) | 5 mM NaCl | Sigma | |
0.17 mM KCl | Sigma | ||
0.33 mM CaCl2 | Sigma | ||
0.33 mM MgSO4 | Sigma | ||
Injection Buffer (pH 7.5) | 20 mM HEPES | Sigma | |
150 mM KCl | Sigma |