Detta protokoll beskriver ett tillvägagångssätt för att underlätta exakta knock-in-redigeringar i zebrafiskembryon med CRISPR-Cas9-teknik. En fenotypningspipeline presenteras för att demonstrera tillämpligheten av dessa tekniker för att modellera en lång QT-syndromassocierad genvariant.
Grupperade regelbundet interspaced korta palindromiska upprepningar (CRISPR) i djurmodeller möjliggör exakt genmanipulation för studier av fysiologiska fenomen. Zebrafisk har använts som en effektiv genetisk modell för att studera många frågor relaterade till ärftlig sjukdom, utveckling och toxikologi på helorgan- och -organismnivå. På grund av det väl kommenterade och kartlagda zebrafiskgenomet har många verktyg för genredigering utvecklats. Effektiviteten av att generera och underlätta att upptäcka exakta knock-in-redigeringar med CRISPR är dock en begränsande faktor. Här beskrivs en CRISPR-Cas9-baserad knock-in-metod med enkel detektering av exakta redigeringar i en gen som är ansvarig för hjärtrepolarisering och associerad med den elektriska störningen, Long QT Syndrome (LQTS). Detta två-en-guide-RNA (sgRNA) tillvägagångssätt skär ut och ersätter målsekvensen och länkar en genetiskt kodad reportergen. Nyttan av detta tillvägagångssätt demonstreras genom att beskriva icke-invasiva fenotypiska mätningar av hjärtats elektriska funktion i vildtyp och genredigerade zebrafisklarver. Detta tillvägagångssätt möjliggör effektiv studie av sjukdomsassocierade varianter i en hel organism. Dessutom erbjuder denna strategi möjligheter för införande av exogena sekvenser av val, såsom reportergener, ortologer eller genredigerare.
CRISPR-baserade genredigeringsstrategier i djurmodeller möjliggör studier av genetiskt ärftlig sjukdom, utveckling och toxikologi på helorganismnivå 1,2,3. Zebrafiskar ger en kraftfull modell som i många fysiologiska aspekter är närmare människor än murina eller mänskliga härledda cellmodeller4. Ett omfattande utbud av genetiska verktyg och strategier har använts i zebrafisk för både framåt5 och omvänd genetisk screening6. Omfattande genetisk kartläggning och annotering hos zebrafisk har underlättat genredigeringsmetoder som en primär teknik för att konstruera riktade genknockouts (KO) och exakta knock-ins (KIs)7.
Trots detta begränsas genereringen av exakta KI-redigeringar i zebrafisk av låg effektivitet och svårigheten att exakt upptäcka. Även om transkriptionsfaktorliknande effektornukleaser (TALENs) framgångsrikt har använts och optimerats för KIs8, ger CRISPR en förbättrad genredigeringsstrategi med enklare sgRNA-inriktning. Många studier har använt CRISPR för att generera exakta KI i zebrafisk 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, även om dessa redigeringar som genereras genom CRISPR-medierad homologistyrd reparation (HDR) tenderar att vara ineffektiva med låg inneboende framgång priser som kräver genotypning som primär skärm 9,10,14,21. Detta visar på behovet av ett effektivt KI CRISPR-system inom zebrafisk, samt ett pålitligt system med hög genomströmning för att upptäcka exakta redigeringar.
Målet med denna studie var att beskriva en plattform för att generera en exakt hjärtgen KI i zebrafiskhjärtan med enkel och hög genomströmningsdetektering av framgångsrika redigeringar. En CRISPR-Cas9-baserad två-sgRNA exon-ersättningsmetod beskrivs, som är baserad på en TALEN-metod8. Detta tillvägagångssätt involverar excision av målsekvensen med hjälp av två-sgRNA-guider och ersättning med en exogen mallsekvens som innehåller KI av intresse samt en genetiskt kodad intronic reportergen (figur 1). Integrationen av en genetiskt kodad fluorescerande reporter i målgenens introniska sekvens möjliggör effektiv detektion av positiva redigeringar. En fenotypningsplattform beskrivs sedan för att bedöma hjärtats elektriska funktion hos zebrafisklarver för icke-invasiv karakterisering av genvarianterna associerade med ärftlig LQTS, en hjärtelektrisk störning som predisponerar individer för plötslig hjärtdöd.
Dessa tillvägagångssätt kommer att förbättra tillgången till och användningen av zebrafisk-KI-genredigeringar för att modellera ärftliga sjukdomar och ta itu med biologiska och fysiologiska frågor, såsom kartläggning av genuttrycksmönster och utvecklingsreglering. Eftersom zebrafiskhjärtan bättre parallella mänskliga hjärtelektrofysiologiska egenskaper än murina modeller, kan de vara särskilt attraktiva som ett genetiskt lätthanterligt system för hjärtsjukdomsmodellering 7,22,23.
Konstruktionen av exakta genredigeringar med CRISPR-Cas9 utmanas av HDR-mekanismernas låga effektivitet och deras effektiva detektering. Här beskrivs en CRISPR-Cas9-baserad två-sgRNA exon-ersättningsmetod som ger exakta redigeringar i zebrafisk med enkel visuell detektering av positiva redigeringar. Effekten av detta tillvägagångssätt demonstreras genom att generera exakta redigeringar i zkcnh6a-genen . Denna uppsats visar hur hjärtfunktionen hos genredigerade zebrafisklarver kan bedömas med hjälp av i…
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöddes av ett kanadensiskt Institutes of Health Research Project-bidrag (T.W.C.) och naturvetenskapliga och tekniska forskningsrådet i Kanada Discovery-bidrag (T.W.C.).
Program | |||
CRISPOR | TEFOR Infrastructure | ||
ENSEMBL | European Bioinformatics Institute | ||
ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | ||
Micro-Manager | Open Source (Github) | ||
NEBiocalculator | New England Biolabs (NEB) | ||
EQUIPMENT | |||
24-well Plate | VWR | ||
25 mm Petri Dish | VWR | ||
Blackfly USB3 Camera | Teledyne FLIR | ||
C1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
Centrifuge 5415C | Eppendorf | ||
EZNA Gel Extraction Kit | Omega Biotek | ||
MAXIscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | ||
MaxQ 5000 Incubator | Barnstead Lab Line | ||
Miniprep Kit | Qiagen | ||
mMessage mMachine T7 Ultra Transcription Kit | Invitrogen | ||
ND1000 Spectrophotometer | Nanodrop | ||
PCR Purification Kit | Qiagen | ||
PLI 100A Picoinjector | Harvard Apparatus | ||
PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | ||
Stemi 305 Steroscope | Zeiss | ||
Wide Mini Sub Cell GT Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
ZebTec Zebrafish Housing System | Tecniplast | ||
SERVICES | |||
Gene Synthesis | Genewiz | ||
Sanger Sequencing | Genewiz | ||
REAGENTS | |||
10β Competent Cells | NEB | ||
10X PCR Buffer | Qiagen | ||
100 mM Nucleotide Mixture | ABM | ||
Ampicillin | Sigma | ||
BamHI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
BsaI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
DR274 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
EcoRI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
Glycerol | |||
HEPES | Sigma | ||
HindIII Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
Kanamycin | Sigma | ||
Methylene Blue | Sigma | ||
MLM3613 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
MS-222 (Tricaine) | Sigma | ||
pKHR5 Plasmid (DH5α bacterial agar stab) | Addgene | ||
PmeI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
SalI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
Sodium Hydroxide | Sigma | ||
T4 Ligase w/ buffer | Sigma | ||
Taq Polymerase | Qiagen | ||
TE Buffer | Sigma | ||
Tris Hydrochloride | Sigma | ||
XhoI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
RECIPES | |||
Solution | Component | Supplier | |
Annealing Buffer (pH 7.5-8.0) | 10 mM Tris | Sigma | |
50 mM NaCl | Sigma | ||
1 mM EDTA | Sigma | ||
E3 Media (pH 7.2) | 5 mM NaCl | Sigma | |
0.17 mM KCl | Sigma | ||
0.33 mM CaCl2 | Sigma | ||
0.33 mM MgSO4 | Sigma | ||
Injection Buffer (pH 7.5) | 20 mM HEPES | Sigma | |
150 mM KCl | Sigma |