感染性単核球症の小児からの末梢血サンプル中の免疫細胞亜集団の分離
Summary
免疫磁気ビーズと蛍光活性化細胞ソーティングを組み合わせて、末梢血単核球(単球、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、B細胞、およびナチュラルキラー細胞)の定義された免疫細胞サブポピュレーションを分離および分析する方法について説明します。この方法を使用すると、磁気および蛍光標識された細胞を精製および分析できます。
Abstract
感染性単核球症(IM)は、主に原発性エプスタインバーウイルス(EBV)感染に関連する急性症候群です。主な臨床症状には、不規則な発熱、リンパ節腫脹、および末梢血中のリンパ球の有意な増加が含まれます。IMの発症メカニズムはまだ不明です。それに対する効果的な治療法はなく、主に対症療法が利用可能です。EBV免疫生物学の主な疑問は、感染した個人のごく一部だけが重篤な臨床症状を示し、EBV関連の悪性腫瘍を発症することさえあるのに対し、ほとんどの個人はウイルスで一生無症候性である理由です。
B細胞は、EBV受容体がその表面に提示されるため、最初にIMに関与します。ナチュラルキラー(NK)細胞は、EBV感染細胞を殺すために重要な細胞傷害性の自然リンパ球です。CD4+ T細胞の割合は減少しますが、CD8+ T細胞の割合は急性EBV感染時に劇的に拡大し、CD8+ T細胞の持続性はIMの生涯にわたる制御にとって重要です。これらの免疫細胞はIMにおいて重要な役割を果たしており、その機能は個別に同定する必要があります。この目的のために、単球は、CD14マイクロビーズ、カラム、および磁気分離器を使用して、IM個体の末梢血単核球(PBMC)から最初に分離される。
残りのPBMCをペリジニン-クロロフィルタンパク質(PerCP)/シアニン5.5抗CD3、アロフィコシアニン(APC)/シアニン7抗CD4、フィコエリスリン(PE)抗CD8、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)抗CD19、APC抗CD56、およびAPC抗CD16抗体で染色し、フローサイトメーターを使用してCD4+ T細胞、CD8+ T細胞、B細胞、およびNK細胞を選別します。さらに、5つの亜集団のトランスクリプトームシーケンシングを実施し、IMにおけるそれらの機能と病原性メカニズムを調査しました。
Introduction
ヒトヘルペスウイルス4型としても知られるγヘルペスウイルスであるエプスタインバーウイルス(EBV)は、ヒト集団に遍在しており、成人人口の90%以上で生涯にわたる潜伏感染を確立しています1。ほとんどのEBV一次感染は小児期および青年期に発生し、一部の患者は感染性単核球症(IM)2を呈し、血液中のCD8+ T細胞による活性化免疫応答や中咽頭3におけるEBV感染B細胞の一時的な増殖などの特徴的な免疫病理を示します。IMの経過は2〜6週間続く可能性があり、患者の大多数はよく回復します4。しかし、一部の個人は、慢性活動性EBV感染症(CAEBV)5に分類される、高い罹患率および死亡率を伴う持続性または再発性のIM様症状を発症します。さらに、EBVは重要な発癌性ウイルスであり、鼻咽頭癌、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫(HL)、T/NK細胞リンパ腫などの類上皮性およびリンパ系悪性腫瘍を含むさまざまな悪性腫瘍と密接に関連しています6。EBVは50年以上にわたって研究されてきましたが、その病因やリンパ球の増殖を誘導するメカニズムは完全には解明されていません。
いくつかの研究は、トランスクリプトームシーケンシングによるEBV感染の免疫病理学の分子シグネチャを調査しています。Zhong et al.は、IMまたはCAEBVの中国の子供の末梢血単核細胞(PBMC)の全トランスクリプトームプロファイリングを分析し、CD8+ T細胞の増殖が主にIMグループ7で見られ、CD8+ T細胞がIMで主要な役割を果たしている可能性があることを発見しました。同様に、別の研究では、EBVの再活性化と他の薬剤の両方によって引き起こされるIMの患者よりも、原発性EBV感染によって引き起こされたIM患者では、EBV特異的細胞傷害性T細胞およびCD19+ B細胞の割合が低く、CD8 + T細胞の割合が高いことがわかりました8。B細胞は、EBV受容体がその表面に提示されるため、最初にIMに関与します。Al Tabaaらは、IM9の間にB細胞が多クローン的に活性化され、形質芽細胞(CD19+、CD27+およびCD20−、およびCD138−細胞)および形質細胞(CD19+、CD27+およびCD20−、ならびにCD138+)に分化することを発見した。さらに、Zhongらは、単球マーカーCD14およびCD64がCAEBVでアップレギュレーションされていることを発見し、単球が抗体依存性細胞傷害(ADCC)および活動亢進食作用を介してCAEBVの細胞性免疫応答に重要な役割を果たす可能性があることを示唆しています7。Alkaらは、IMまたはHLの4人の患者からのMACSソーティングCD56dim CD16+ NK細胞のトランスクリプトームを特徴付け、IMおよびHLの両方のNK細胞が自然免疫およびケモカインシグナル伝達遺伝子を下方制御し、NK細胞の低応答性の原因となる可能性があることを発見しました10。さらに、Greenoughらは、IMを有する個体の10個のPBMCからの選別されたCD8+ T細胞の遺伝子発現を分析した。彼らは、IM中のCD8+ T細胞の大部分がウイルス特異的であり、活性化され、分裂し、エフェクター活性を発揮するようにプライミングされていることを報告しました11。T細胞を介したEBV特異的応答とNK細胞を介した非特異的応答の両方が、一次EBV感染中に重要な役割を果たします。しかし、これらの研究は、免疫細胞の多様な混合物またはリンパ球の特定の亜集団のみのトランスクリプトーム結果を調査しただけであり、同じ疾患状態のIMを有する小児における異なる免疫細胞亜集団の分子特性および機能の包括的な比較には十分ではない。
この論文では、免疫磁気ビーズと蛍光活性化セルソーティング(FACS)を組み合わせて、PBMC(単球、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、B細胞、およびNK細胞)の定義された免疫細胞亜集団を分離および分析する方法について説明します。この方法を使用すると、磁気および蛍光標識された細胞を磁気分離器およびFACSを使用して精製するか、フローサイトメトリーによって分析することができます。RNAは、トランスクリプトームシーケンシングのために精製細胞から抽出することができる。この方法により、IM患者の同じ疾患状態における異なる免疫細胞の特性評価と遺伝子発現が可能になり、EBV感染の免疫病理学の理解が広がります。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、末梢血免疫細胞亜集団を分類する効率的な方法を表しています。この研究では、IM患者、健康なEBVキャリア、およびEBVに感染していない子供からの静脈血サンプルが研究目的として選択されました。IMの患者の末梢血を使用したこの作業は、主にマルチカラーフローサイトメトリーによるさまざまな細胞サブセットの比率の分析と決定に焦点を当てています。トランスクリ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家自然科学財団(82002130)、北京自然科学財団(7222059)、およびCAMS医学イノベーション基金(2019-I2M-5-026)の支援を受けました。
Materials
| APC anti-human CD16 | Biolegend | 302012 | Fluorescent antibody |
| APC anti-human CD56 (NCAM) | Biolegend | 362504 | Fluorescent antibody |
| APC/Cyanine7 anti-human CD4 | Biolegend | 344616 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSAria fluorescence-activated flow cell sorter-cytometer (BD FACSAria II) | Becton, Dickinson and Company | 644832 | Cell sort |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | microbeads |
| Cell ctng slides | BIO RAD | 1450016 | Cell count |
| Centrifuge tubes | Falcon | 35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| EDTA (≥99%, BioPremium) | Beyotime | ST1303 | EDTA |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes | Becton, Dickinson and Company | 367862 | EDTA anticoagulant tubes |
| FITC anti-human CD19 | Biolegend | 302206 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Human lymphocyte separation medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque |
| LS Separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Separation columns |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | Magnetic bead separator |
| PE anti-human CD8 | Biolegend | 344706 | Fluorescent antibody |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3 | Biolegend | 344808 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Polystyrene round bottom tubes | Falcon | 352235 | 5 mL tube for FACS flow cytometer |
| TRIzol reagent | Ambion | 15596024 | Lyse cells for RNA extraction |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
Riferimenti
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