传染性单核细胞增多症儿童外周血样本中免疫细胞亚群的分离
Summary
我们描述了一种结合免疫磁珠和荧光激活细胞分选的方法，以分离和分析外周血单核细胞（单核细胞，CD4 + T细胞，CD8 + T细胞，B细胞和自然杀伤细胞）的已定义免疫细胞亚群。使用这种方法，可以纯化和分析磁性和荧光标记的细胞。
Abstract
传染性单核细胞增多症 （IM） 是一种急性综合征，主要与原发性 EB 病毒 （EBV） 感染有关。主要临床症状包括不规则发热、淋巴结肿大和外周血淋巴细胞明显增多。IM的致病机制尚不清楚;目前尚无有效的治疗方法，主要有对症治疗。EBV免疫生物学中的主要问题是，为什么只有一小部分感染者表现出严重的临床症状，甚至发展为EBV相关的恶性肿瘤，而大多数人在病毒中终生无症状。
B细胞首先参与IM，因为EBV受体存在于其表面。自然杀伤（NK）细胞是细胞毒性先天淋巴细胞，对杀死EBV感染的细胞很重要。在急性EBV感染期间，CD4 + T细胞的比例降低，而CD8 + T细胞的比例急剧扩大，CD8 + T细胞的持久性对于IM的终身控制很重要。这些免疫细胞在IM中起着重要作用，它们的功能需要单独识别。为此，首先使用CD14微珠，色谱柱和磁分离器从IM个体的外周血单核细胞（PBMC）中分离单核细胞。
其余PBMC用peridinin-叶绿素蛋白（PerCP）/花青素5.5抗CD3、别藻蓝蛋白（APC）/花青7抗CD4、藻红蛋白（PE）抗CD8、异硫氰酸荧光素（FITC）抗CD19、APC抗CD56和APC抗CD16抗体染色，以使用流式细胞仪分选CD4 + T细胞，CD8 + T细胞，B细胞和NK细胞。此外，对5个亚群进行转录组测序，探讨其在IM中的功能和致病机制。
Introduction
EB 病毒 （EBV） 是一种γ疱疹病毒，也称为人类疱疹病毒 4 型，在人群中普遍存在，并在 90% 以上的成年人口中建立终生潜伏感染1。大多数 EBV 原发性感染发生在儿童期和青春期，少数患者表现为传染性单核细胞增多症 （IM）2，表现出特征性免疫病理学，包括血液中 CD8+ T 细胞的激活免疫应答和口咽部 EBV 感染的 B 细胞短暂增殖3。IM的病程可能持续2-6周，大多数患者恢复良好4。然而，有些人会出现持续性或复发性IM样症状，发病率和死亡率很高，这被归类为慢性活动性EBV感染（CAEBV）5。此外，EB病毒是一种重要的致癌病毒，与多种恶性肿瘤密切相关，包括鼻咽癌、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤（HL）和T/NK细胞淋巴瘤6等上皮样和淋巴恶性肿瘤。尽管EB病毒已经研究了50多年，但其发病机制和诱导淋巴细胞增殖的机制尚未完全阐明。
一些研究已经通过转录组测序研究了EBV感染免疫病理学的分子特征。钟等分析了中国IM或CAEBV患儿外周血单核细胞（PBMC）的全转录组分析，发现CD8+T细胞扩增主要见于IM组7，提示CD8+T细胞可能在IM中起主要作用。同样，另一项研究发现，与由EBV再激活和其他药物引起的IM患者相比，原发性EBV感染引起的IM患者中EBV特异性细胞毒性T和CD19 + B细胞的比例较低，CD8 + T细胞的百分比较高8。B细胞首先参与IM，因为EBV受体存在于其表面。Al Tabaa等人发现B细胞在IM9期间被多克隆激活和分化的原浆母细胞（CD19+，CD27+和CD20−以及CD138−细胞）和浆细胞（CD19+，CD27+和CD20−以及CD138+）。此外，Zhong等人发现单核细胞标志物CD14和CD64在CAEBV中上调，表明单核细胞可能通过抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和过度活跃的吞噬作用在CAEBV的细胞免疫应答中发挥重要作用7。Alka等人对来自四名IM或HL患者的MACS分选CD56暗CD16 + NK细胞的转录组进行了表征，发现来自IM和HL的NK细胞具有下调的先天免疫和趋化因子信号基因，这可能是NK细胞低反应的原因10。此外，Greenough等人分析了来自IM个体的10个PBMC的分选CD8 + T细胞的基因表达。他们报告说，IM中很大一部分CD8 + T细胞具有病毒特异性，激活，分裂，并已准备好发挥效应活性11。在原发性 EBV 感染期间，T 细胞介导的 EBV 特异性反应和 NK 细胞介导的非特异性应答都起着至关重要的作用。然而，这些研究仅研究了免疫细胞多种混合物或仅研究特定淋巴细胞亚群的转录组结果，不足以全面比较同一疾病状态下IM患儿不同免疫细胞亚群的分子特征和功能。
本文描述了一种结合免疫磁珠和荧光激活细胞分选（FACS）来分离和分析PBMC的明确免疫细胞亚群（单核细胞，CD4 + T细胞，CD8 + T细胞，B细胞和NK细胞）的方法。使用这种方法，可以使用磁选机和FACS纯化磁性和荧光标记的细胞或通过流式细胞术进行分析。可以从纯化的细胞中提取RNA进行转录组测序。该方法将使IM个体在相同疾病状态下的不同免疫细胞的表征和基因表达成为可能，这将扩展我们对EBV感染免疫病理学的理解。
Protocol
Representative Results
Discussion
该协议代表了对外周血免疫细胞亚群进行分类的有效方法。本研究选取IM患者、健康EBV携带者和EBV未感染儿童的静脉血样作为研究目标。本工作使用IM患者的外周血，主要侧重于通过多色流式细胞术分析和确定不同细胞亚群的比例。转录组测序主要用于检测和分析同一疾病状态下IM患儿不同免疫细胞亚群中不足以全面、特异性比较不同免疫细胞亚群的淋巴细胞亚群。因此，从外周血中分离出几种类?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了国家自然科学基金（82002130）、北京自然科学基金（7222059）和中国医学科学院医学创新基金（2019-I2M-5-026）的支持。
Materials
| APC anti-human CD16 | Biolegend | 302012 | Fluorescent antibody |
| APC anti-human CD56 (NCAM) | Biolegend | 362504 | Fluorescent antibody |
| APC/Cyanine7 anti-human CD4 | Biolegend | 344616 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSAria fluorescence-activated flow cell sorter-cytometer (BD FACSAria II) | Becton, Dickinson and Company | 644832 | Cell sort |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | microbeads |
| Cell ctng slides | BIO RAD | 1450016 | Cell count |
| Centrifuge tubes | Falcon | 35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| EDTA (≥99%, BioPremium) | Beyotime | ST1303 | EDTA |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes | Becton, Dickinson and Company | 367862 | EDTA anticoagulant tubes |
| FITC anti-human CD19 | Biolegend | 302206 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Human lymphocyte separation medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque |
| LS Separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Separation columns |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | Magnetic bead separator |
| PE anti-human CD8 | Biolegend | 344706 | Fluorescent antibody |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3 | Biolegend | 344808 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Polystyrene round bottom tubes | Falcon | 352235 | 5 mL tube for FACS flow cytometer |
| TRIzol reagent | Ambion | 15596024 | Lyse cells for RNA extraction |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
Riferimenti
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