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Bioingegneria

SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인을 표시하는 외막 소포를 기반으로 하는 "플러그 앤 디스플레이" 나노입자 백신 플랫폼

Published: July 25, 2022
doi:
10.3791/64213
, , , , , ,
1National Engineering Research Center of Immunological Products, Department of Microbiology and Biochemical Pharmacy, College of Pharmacy,Third Military Medical University

Summary

본 프로토콜은 외막 소포의 생명공학을 생산, 정제, 생체접합 및 특성화를 포함하는 “플러그 앤 디스플레이” 백신 플랫폼으로 설명합니다.

Abstract

박테리아 또는 바이러스로부터 얻은 생체 모방 나노 입자는 백신 연구 및 개발에 상당한 관심을 끌었습니다. 외막 소포(OMV)는 평균 성장 동안 주로 그람 음성 박테리아에 의해 분비되며, 나노 크기의 직경과 자가 보조 활성을 가지고 있어 백신 전달에 이상적일 수 있습니다. OMV는 단백질, 핵산 및 소분자에 대한 다면적 전달 시스템으로 기능했습니다. OMV의 생물학적 특성을 최대한 활용하기 위해 생체 공학 대장균 유래 OMV를 운반체로, SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인(RBD)을 항원으로 활용하여 “플러그 앤 디스플레이” 백신 플랫폼을 구축했습니다. 스트렙토코커스 화농성 내의 SpyCatcher (SC) 및 SpyTag (ST) 도메인을 접합체 OMV 및 RBD에 적용하였다. Cytolysin A (ClyA) 유전자는 플라스미드 형질 감염 후 융합 단백질로서 SC 유전자와 함께 번역되어 OMV 표면에 반응 부위를 남겼습니다. 종래의 완충 시스템에서 RBD-ST를 밤새 혼합한 후, OMV와 RBD 사이에 공유 결합이 형성되었다. 따라서, 다가 표시 OMV 백신이 달성되었다. OMV 백신 플랫폼은 다양한 항원으로 대체함으로써 다양한 이종 항원을 효율적으로 표시하여 잠재적으로 전염병 전염병을 신속하게 예방할 수 있습니다. 이 프로토콜은 생산, 정제, 생체 접합 및 특성화를 포함하여 OMV 백신 플랫폼을 구성하는 정확한 방법을 설명합니다.

Introduction

잠재적인 백신 플랫폼으로서 외막 소포(OMV)는최근 몇 년 동안 점점 더 많은 관심을 끌고 있습니다1,2. 주로 그람 음성 박테리아3에 의해 자연적으로 분비되는 OMV는 일반적으로 20-300 nm4 크기의 지질 이중층으로 구성된 구형 나노 스케일 입자입니다. OMV에는 박테리아 항원 및 병원체 관련 분자 패턴(PAMP)을 포함한 다양한 모 박테리아 구성 요소가 포함되어 있으며, 이는 고체 면역 강화제역할을 합니다5. OMV는 고유한 구성 요소, 천연 소포 구조 및 우수한 유전 공학 변형 부위의 이점을 활용하여 박테리아 백신6, 보조제7, 암 면역 요법 약물8, 약물 전달 벡터9 및 항균 접착제10을 포함한 많은 생물 의학 분야에서 사용하기 위해 개발되었습니다.

2020년부터 전 세계적으로 확산된 SARS-CoV-2 팬데믹은 글로벌 사회에 큰 타격을 입혔습니다. 스파이크 단백질 (S 단백질)의 수용체 결합 도메인 (RBD)은 인간 안지오텐신 전환 효소 2 (ACE2)와 결합 할 수 있으며, 이는 세포11,12,13으로의 바이러스 진입을 매개합니다. 따라서 RBD는 백신 발견14,15,16의 주요 표적인 것으로 보입니다. 그러나, 단량체 RBD는 면역원성이 좋지 않고, 분자량이 작기 때문에 면역계가 인식하기 어렵기 때문에 보조제가 종종 필요하다17.

RBD의 면역원성을 증가시키기 위해, 다가 RBD를 나타내는 OMV가 구축되었다. RBD를 표시하기 위해 OMV를 사용하는 기존 연구는 일반적으로 RBD를 OMV와 융합하여 박테리아18에서 발현됩니다. 그러나 RBD는 바이러스 유래 단백질이며 원핵 생물 발현이 그 활성에 영향을 미칠 가능성이 있습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 스트렙토코커스 화농성으로부터 유래된 SpyTag (ST)/SpyCatcher (SC) 시스템을 사용하여 종래의 완충 시스템19에서 OMV 및 RBD와 공유 이소펩타이드를 형성하였다. SC 도메인은 생체 공학 대장균에 의한 융합 단백질로서 Cytolysin A (ClyA)로 발현되었고, ST는 HEK293F 세포 발현 시스템을 통해 RBD로 발현되었다. OMV-SC 및 RBD-ST를 혼합하고 밤새 배양하였다. 초원심분리 또는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 정제 후, OMV-RBD를 수득하였다.

Protocol

1. 플라스미드 구성 SpyCatcher 서열을 코딩하는 DNA (보충 파일 1)를 BamH I 및 Sal I 부위 사이의 암피실린 내성 pThioHisA-ClyA 플라스미드 (재료 표 참조)에 삽입하여 이전에 발표 된 보고서20에 따라 플라스미드 pThioHisA ClyA-SC를 구축합니다. 합성된 SpyTag-RBD-Histag 융합 유전자(보충 파일 1)를 BamH I 및 EcoR I 부위 사이의 pc…

Representative Results

이 프로토콜의 순서도는 그림 1에 나와 있습니다. 이 프로토콜은 OMV를 백신 플랫폼으로 활용하는 일반적인 접근 방식일 수 있습니다. 항원의 유형에 따라 적절한 발현 시스템을 선택하기 만하면됩니다. 도 2는 실현 가능한 플라스미드 설계 스킴을 제공한다. SC 유전자는 유연한 링커를 통해 ClyA 유전자와 연결되고, ST는 정제 및 검증…

Discussion

“플러그 앤 디스플레이” 나노입자 백신 플랫폼을 만들기 위해 SC 융합 ClyA는 단백질 발현24의 장점으로 인해 재조합 단백질 생산에 가장 널리 사용되는 모델 중 하나인 BL21(DE3) 균주에서 발현되어 박테리아 증식 과정에서 OMV 표면에 충분한 SC 단편이 표시됩니다. 동시에, 항원과 OMV 사이의 화학적 결합을 위해 ST-융합 표적 항원을 제조하였다. 이 실험 계획의 장점과 향후 적용 전망?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 충칭 자연 과학 재단의 핵심 프로그램 (No. cstc2020jcyj-zdxmX0027) 및 중국 국립 자연 과학 재단 프로젝트 (No. 31670936, 82041045).

Materials

Ampicillin sodium Sangon Biotech A610028
Automated cell counter Countstar BioTech
BCA protein quantification Kit cwbio cw0014s
ChemiDoc Touching Imaging System Bio-rad
Danamic Light Scattering Malvern Zetasizer Nano S90
Electrophoresis apparatus Cavoy Power BV
EZ-Buffers H 10X TBST Buffer Sangon Biotech C520009
Goat pAb to mouse IgG1 Abcam ab97240
High speed freezing centrifuge Bioridge H2500R
His-Tag mouse mAb Cell signaling technology 2366s
Imidazole Sangon Biotech A600277
Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Sangon Biotech A600118
Ni-NTA His-Bind Superflow Qiagen 70691
Non-fat powdered milk Sangon Biotech A600669
OPM-293 cell culture medium Opm biosciences 81075-001
pcDNA3.1 RBD-ST plasmid Wuhan genecreat biological techenology
Phosphate buffer saline ZSGB-bio ZLI-9061
Polyethylenimine Linear Polysciences 23966-1
Prestained protein ladder Thermo 26616
pThioHisA ClyA-SC plasmid Wuhan genecreat biological techenology
PVDF Western Blotting Membranes Roche 03010040001
Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column) GE healthcare
SDS-PAGE loading buffer (5x) Beyotime P0015
Sodium chloride Sangon Biotech A100241
Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution) Thermo 34577
Suspension instrument Life Technology Hula Mixer
Transmission Electron Microscope Hitachi HT7800
Tryptone Oxoid LP0042B
Ultracentrifuge Beckman coulter XPN-100
Ultraviolet spectrophotometer Hitachi U-3900
Yeast extract Sangon Biotech A610961
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Riferimenti

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Keywords: Nanoparticle VaccineOuter Membrane VesiclesSARS-CoV-2 Receptor-binding DomainAntigen DisplayCytolysin A SpycatcherOMV Spycatcher ProductionOMV Spycatcher PurificationRBD Spytag TransfectionEukaryotic Expression System
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Citazione di questo articolo
Feng, R., Li, G., Jing, H., Liu, C., Xue, R., Zou, Q., Li, H. A “Plug-And-Display” Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain. J. Vis. Exp. (185), e64213, doi:10.3791/64213 (2022).
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