Une plate-forme vaccinale à nanoparticules « plug-and-display » basée sur des vésicules de membrane externe présentant un domaine de liaison au récepteur du SRAS-CoV-2
Summary
Le présent protocole décrit la bio-ingénierie des vésicules de membrane externe comme une plateforme vaccinale « Plug-and-Display », y compris la production, la purification, la bioconjugaison et la caractérisation.
Abstract
Les nanoparticules biomimétiques obtenues à partir de bactéries ou de virus ont suscité un intérêt considérable dans la recherche et le développement de vaccins. Les vésicules de la membrane externe (OMV) sont principalement sécrétées par les bactéries à Gram négatif pendant la croissance moyenne, avec un diamètre nanométrique et une activité auto-adjuvante, ce qui peut être idéal pour l’administration du vaccin. Les OMV ont fonctionné comme un système d’administration à multiples facettes pour les protéines, les acides nucléiques et les petites molécules. Pour tirer pleinement parti des caractéristiques biologiques des OMV, les OMV dérivés d’Escherichia coli issus du bio-ingénierie ont été utilisés comme porteur et le domaine de liaison au récepteur du SARS-CoV-2 (RBD) comme antigène pour construire une plate-forme vaccinale « Plug-and-Display ». Les domaines SpyCatcher (SC) et SpyTag (ST) de Streptococcus pyogenes ont été appliqués aux OMV et RBD conjugués. Le gène de la cytolysine A (ClyA) a été traduit avec le gène SC en protéine de fusion après transfection plasmidique, laissant un site réactif à la surface des OMV. Après avoir mélangé RBD-ST dans un système tampon conventionnel pendant la nuit, une liaison covalente s’est formée entre les OMV et les RBD. Ainsi, un vaccin multivalent OMV a été obtenu. En les remplaçant par divers antigènes, la plateforme vaccinale OMVs peut afficher efficacement une variété d’antigènes hétérogènes, prévenant ainsi potentiellement rapidement les épidémies de maladies infectieuses. Ce protocole décrit une méthode précise pour construire la plateforme vaccinale OMV, y compris la production, la purification, la bioconjugaison et la caractérisation.
Introduction
En tant que plate-forme vaccinale potentielle, les vésicules de membrane externe (OMV) ont attiré de plus en plus d’attention ces dernières années 1,2. Les OMV, principalement sécrétées naturellement par les bactéries à Gram négatif3, sont des particules sphériques à l’échelle nanométrique composées d’une bicouche lipidique, généralement de la taille de 20-300nm4. Les OMV contiennent divers composants bactériens parentaux, y compris des antigènes bactériens et des profils moléculaires associés à des agents pathogènes (PAMP), qui servent de potentialisateurs immunitaires solides5. Bénéficiant de leurs composants uniques, de la structure naturelle des vésicules et des grands sites de modification du génie génétique, les OMV ont été développés pour être utilisés dans de nombreux domaines biomédicaux, notamment les vaccins bactériens6, les adjuvants7, les médicaments d’immunothérapieanticancéreuse 8, les vecteurs d’administration de médicaments9 et les adhésifs antibactériens10.
La pandémie de SRAS-CoV-2, qui s’est propagée dans le monde entier depuis 2020, a fait payer un lourd tribut à la société mondiale. Le domaine de liaison au récepteur (RBD) dans la protéine de pointe (protéine S) peut se lier à l’enzyme 2 de conversion de l’angiotensine humaine (ACE2), qui intervient ensuite dans l’entrée du virus dans la cellule11,12,13. Ainsi, le TCSP semble être une cible de choix pour la découverte de vaccins14,15,16. Cependant, le TCSP monomère est peu immunogène et son faible poids moléculaire le rend difficile à reconnaître par le système immunitaire, de sorte que des adjuvants sont souvent nécessaires17.
Afin d’augmenter l’immunogénicité des TCSP, des OMV présentant des RBD polyvalents ont été construits. Les études existantes utilisant OMV pour afficher RBD fusionnent généralement RBD avec OMV pour être exprimé dans les bactéries18. Cependant, le TCSP est une protéine dérivée d’un virus, et l’expression procaryote est susceptible d’affecter son activité. Pour résoudre ce problème, le système SpyTag (ST)/SpyCatcher (SC), dérivé de Streptococcus pyogenes, a été utilisé pour former un isopeptide covalent avec OMV et RBD dans un système tampon conventionnel19. Le domaine SC a été exprimé avec la cytolysine A (ClyA) en tant que protéine de fusion par Escherichia coli issu de la bio-ingénierie, et ST a été exprimé avec RBD via le système d’expression cellulaire HEK293F. OMV-SC et RBD-ST ont été mélangés et incubés pendant la nuit. Après purification par ultracentrifugation ou chromatographie d’exclusion de taille (SEC), OMV-RBD a été obtenu.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour créer une plate-forme vaccinale à nanoparticules « Plug-and-Display », ClyA fusionné SC a été exprimé dans les souches BL21 (DE3), qui est l’un des modèles les plus largement utilisés pour la production de protéines recombinantes en raison de ses avantages dans l’expression des protéines24, de sorte qu’il y aurait suffisamment de fragments SC affichés à la surface des OMV pendant le processus de prolifération bactérienne. Dans le même temps, un antigène cible fusionn…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le programme clé de la Fondation des sciences naturelles de Chongqing (No. cstc2020jcyj-zdxmX0027) et le projet de la Fondation nationale chinoise des sciences naturelles (n° 31670936, 82041045).
Materials
| Ampicillin sodium | Sangon Biotech | A610028 | |
| Automated cell counter | Countstar | BioTech | |
| BCA protein quantification Kit | cwbio | cw0014s | |
| ChemiDoc Touching Imaging System | Bio-rad | ||
| Danamic Light Scattering | Malvern | Zetasizer Nano S90 | |
| Electrophoresis apparatus | Cavoy | Power BV | |
| EZ-Buffers H 10X TBST Buffer | Sangon Biotech | C520009 | |
| Goat pAb to mouse IgG1 | Abcam | ab97240 | |
| High speed freezing centrifuge | Bioridge | H2500R | |
| His-Tag mouse mAb | Cell signaling technology | 2366s | |
| Imidazole | Sangon Biotech | A600277 | |
| Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside | Sangon Biotech | A600118 | |
| Ni-NTA His-Bind Superflow | Qiagen | 70691 | |
| Non-fat powdered milk | Sangon Biotech | A600669 | |
| OPM-293 cell culture medium | Opm biosciences | 81075-001 | |
| pcDNA3.1 RBD-ST plasmid | Wuhan genecreat biological techenology | ||
| Phosphate buffer saline | ZSGB-bio | ZLI-9061 | |
| Polyethylenimine Linear | Polysciences | 23966-1 | |
| Prestained protein ladder | Thermo | 26616 | |
| pThioHisA ClyA-SC plasmid | Wuhan genecreat biological techenology | ||
| PVDF Western Blotting Membranes | Roche | 03010040001 | |
| Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column) | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE loading buffer (5x) | Beyotime | P0015 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A100241 | |
| Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution) | Thermo | 34577 | |
| Suspension instrument | Life Technology | Hula Mixer | |
| Transmission Electron Microscope | Hitachi | HT7800 | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
| Ultracentrifuge | Beckman coulter | XPN-100 | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Hitachi | U-3900 | |
| Yeast extract | Sangon Biotech | A610961 |
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