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Bioingegneria

Eine "Plug-and-Display"-Nanopartikel-Impfstoffplattform basierend auf äußeren Membranvesikeln mit SARS-CoV-2-Rezeptorbindungsdomäne

Published: July 25, 2022
doi:
10.3791/64213
, , , , , ,
1National Engineering Research Center of Immunological Products, Department of Microbiology and Biochemical Pharmacy, College of Pharmacy,Third Military Medical University

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt das Bioengineering von äußeren Membranvesikeln als “Plug-and-Display”-Impfstoffplattform, einschließlich Produktion, Reinigung, Biokonjugation und Charakterisierung.

Abstract

Biomimetische Nanopartikel, die aus Bakterien oder Viren gewonnen werden, haben großes Interesse an der Impfstoffforschung und -entwicklung geweckt. Äußere Membranvesikel (OMVs) werden hauptsächlich von gramnegativen Bakterien während des durchschnittlichen Wachstums mit einem Durchmesser in Nanogröße und selbstadjuvanter Aktivität sezerniert, was ideal für die Impfstoffabgabe sein kann. OMVs haben als facettenreiches Liefersystem für Proteine, Nukleinsäuren und kleine Moleküle funktioniert. Um die biologischen Eigenschaften von OMVs voll auszuschöpfen, wurden biotechnologisch hergestellte Escherichia coli-abgeleitete OMVs als Träger und SARS-CoV-2-Rezeptorbindungsdomäne (RBD) als Antigen verwendet, um eine “Plug-and-Display”-Impfstoffplattform zu konstruieren. Die Domänen SpyCatcher (SC) und SpyTag (ST) in Streptococcus pyogenes wurden angewendet, um OMVs und RBD zu konjugieren. Das Cytolysin A (ClyA)-Gen wurde nach Plasmidtransfektion mit dem SC-Gen als Fusionsprotein übersetzt, wobei eine reaktive Stelle auf der Oberfläche der OMVs zurückblieb. Nach dem Mischen von RBD-ST in einem konventionellen Puffersystem über Nacht wurde eine kovalente Bindung zwischen den OMVs und RBD gebildet. Somit wurde ein multivalent anzeigender OMV Impfstoff erreicht. Durch den Ersatz durch verschiedene Antigene kann die OMVs Impfstoffplattform eine Vielzahl heterogener Antigene effizient darstellen und so Epidemien von Infektionskrankheiten schnell verhindern. Dieses Protokoll beschreibt eine präzise Methode zum Aufbau der OMV Impfstoffplattform, einschließlich Produktion, Reinigung, Biokonjugation und Charakterisierung.

Introduction

Als potenzielle Impfstoffplattform haben äußere Membranvesikel (OMVs) in den letzten Jahren immer mehr Aufmerksamkeit erregt 1,2. OMVs, die hauptsächlich auf natürliche Weise von gramnegativen Bakterien3 sezerniert werden, sind kugelförmige nanoskalige Partikel, die aus einer Lipiddoppelschicht bestehen, normalerweise in der Größe von 20-300nm4. OMVs enthalten verschiedene bakterielle Ausgangskomponenten, einschließlich bakterieller Antigene und pathogenassoziierter molekularer Muster (PAMPs), die als feste Immunpotentiatoren dienen5. OMVs profitieren von ihren einzigartigen Komponenten, ihrer natürlichen Vesikelstruktur und ihren großartigen gentechnischen Modifikationsstellen und wurden für den Einsatz in vielen biomedizinischen Bereichen entwickelt, darunter bakterielle Impfstoffe6, Adjuvantien7, Krebsimmuntherapeutika8, Wirkstoffabgabevektoren9 und antibakterielle Klebstoffe10.

Die SARS-CoV-2-Pandemie, die sich seit 2020 weltweit ausbreitet, hat die globale Gesellschaft stark belastet. Die Rezeptorbindungsdomäne (RBD) im Spike-Protein (S-Protein) kann an das humane Angiotensin-Converting-Enzym 2 (ACE2) binden, das dann den Eintritt des Virus in die Zellevermittelt 11,12,13. Daher scheint RBD ein Hauptziel für die Impfstoffentdeckungzu sein 14,15,16. Monomere RBD ist jedoch schlecht immunogen, und ihr kleines Molekulargewicht erschwert es dem Immunsystem, sie zu erkennen, so dass häufig Adjuvantien erforderlich sind17.

Um die Immunogenität von RBD zu erhöhen, wurden OMVs mit polyvalenten RBDs konstruiert. Bestehende Studien, die OMV zur Darstellung von RBD verwenden, verschmelzen in der Regel RBD mit OMV, um in Bakterien exprimiert zu werden18. RBD ist jedoch ein vom Virus abgeleitetes Protein, und die prokaryotische Expression beeinflusst wahrscheinlich seine Aktivität. Um dieses Problem zu lösen, wurde das von Streptococcus pyogenes abgeleitete SpyTag (ST)/SpyCatcher (SC)-System verwendet, um ein kovalentes Isopeptid mit OMV und RBD in einem konventionellen Puffersystem19 zu bilden. Die SC-Domäne wurde mit Cytolysin A (ClyA) als Fusionsprotein durch biotechnologisch hergestellte Escherichia coli exprimiert, und ST wurde mit RBD über das HEK293F-Zellexpressionssystem exprimiert. OMV-SC und RBD-ST wurden über Nacht gemischt und inkubiert. Nach Reinigung durch Ultrazentrifugation oder Größenausschlusschromatographie (SEC) wurde OMV-RBD erhalten.

Protocol

1. Plasmidaufbau Fügen Sie DNA, die die SpyCatcher-Sequenz (Supplementary File 1) kodiert, in ein Ampicillin-resistentes pThioHisA-ClyA-Plasmid (siehe Materialtabelle) zwischen den Stellen BamH I und Sal I ein, um das Plasmid pThioHisA ClyA-SC nach einem zuvor veröffentlichten Bericht zu konstruieren20. Ligate das synthetisierte SpyTag-RBD-Histag-Fusionsgen (Supplementary File 1) in ein pcDNA3.1-Plas…

Representative Results

Das Flussdiagramm für dieses Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. Dieses Protokoll könnte ein allgemeiner Ansatz zur Nutzung von OMVs als Impfstoffplattform sein. Man muss nur die geeigneten Expressionssysteme basierend auf der Art der Antigene auswählen. Abbildung 2 zeigt ein realisierbares Plasmid-Design-Schema. Das SC-Gen ist über einen flexiblen Linker mit dem ClyA-Gen verbunden, während ST mit dem 5′-Terminal des RBD-Ge…

Discussion

Um eine “Plug-and-Display”-Nanopartikel-Impfstoffplattform zu schaffen, wurde SC-fusioniertes ClyA in BL21(DE3)-Stämmen exprimiert, die aufgrund ihrer Vorteile bei der Proteinexpression24 eines der am weitesten verbreiteten Modelle für die rekombinante Proteinproduktion sind, so dass während des Prozesses der Bakterienproliferation genügend SC-Fragmente auf der Oberfläche der OMVs angezeigt werden. Gleichzeitig wurde ein ST-fusioniertes Zielantigen für die chemische Kopplung zwischen den Ant…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde vom Key Program der Chongqing Natural Science Foundation (No. cstc2020jcyj-zdxmX0027) und das Chinese National Natural Science Foundation Project (Nr. 31670936, 82041045).

Materials

Ampicillin sodium Sangon Biotech A610028
Automated cell counter Countstar BioTech
BCA protein quantification Kit cwbio cw0014s
ChemiDoc Touching Imaging System Bio-rad
Danamic Light Scattering Malvern Zetasizer Nano S90
Electrophoresis apparatus Cavoy Power BV
EZ-Buffers H 10X TBST Buffer Sangon Biotech C520009
Goat pAb to mouse IgG1 Abcam ab97240
High speed freezing centrifuge Bioridge H2500R
His-Tag mouse mAb Cell signaling technology 2366s
Imidazole Sangon Biotech A600277
Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Sangon Biotech A600118
Ni-NTA His-Bind Superflow Qiagen 70691
Non-fat powdered milk Sangon Biotech A600669
OPM-293 cell culture medium Opm biosciences 81075-001
pcDNA3.1 RBD-ST plasmid Wuhan genecreat biological techenology
Phosphate buffer saline ZSGB-bio ZLI-9061
Polyethylenimine Linear Polysciences 23966-1
Prestained protein ladder Thermo 26616
pThioHisA ClyA-SC plasmid Wuhan genecreat biological techenology
PVDF Western Blotting Membranes Roche 03010040001
Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column) GE healthcare
SDS-PAGE loading buffer (5x) Beyotime P0015
Sodium chloride Sangon Biotech A100241
Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution) Thermo 34577
Suspension instrument Life Technology Hula Mixer
Transmission Electron Microscope Hitachi HT7800
Tryptone Oxoid LP0042B
Ultracentrifuge Beckman coulter XPN-100
Ultraviolet spectrophotometer Hitachi U-3900
Yeast extract Sangon Biotech A610961
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Riferimenti

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Keywords: Nanoparticle VaccineOuter Membrane VesiclesSARS-CoV-2 Receptor-binding DomainAntigen DisplayCytolysin A SpycatcherOMV Spycatcher ProductionOMV Spycatcher PurificationRBD Spytag TransfectionEukaryotic Expression System
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Feng, R., Li, G., Jing, H., Liu, C., Xue, R., Zou, Q., Li, H. A “Plug-And-Display” Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain. J. Vis. Exp. (185), e64213, doi:10.3791/64213 (2022).
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