פלטפורמת חיסון ננו-חלקיקים "plug-and-display" המבוססת על שלפוחיות ממברנה חיצוניות המציגות תחום קשירת קולטן SARS-CoV-2
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הביו-הנדסה של שלפוחיות הממברנה החיצונית כפלטפורמת חיסון “Plug-and-Display”, כולל ייצור, טיהור, ביו-קונגציה ואפיון.
Abstract
ננו-חלקיקים ביומימטיים המתקבלים מחיידקים או מווירוסים משכו עניין רב במחקר ובפיתוח חיסונים. שלפוחיות הממברנה החיצונית (OMVs) מופרשות בעיקר על ידי חיידקים גראם-שליליים במהלך גדילה ממוצעת, עם קוטר בגודל ננומטרי ופעילות אדג’ובנטית עצמית, שעשויה להיות אידיאלית להעברת חיסונים. OMVs תפקדו כמערכת אספקה רבת פנים לחלבונים, חומצות גרעין ומולקולות קטנות. כדי לנצל את מלוא המאפיינים הביולוגיים של OMVs, נעשה שימוש ב-OMVs שמקורם ב-Escherichia coli שעברו הנדסה ביולוגית כנשא ותחום קשירת קולטן SARS-CoV-2 (RBD) כאנטיגן לבניית פלטפורמת חיסון “הכנס-והצג”. תחומי SpyCatcher (SC) ו- SpyTag (ST) בסטרפטוקוקוס פיוגנס יושמו כדי להצמיד OMVs ו- RBD. הגן Cytolysin A (ClyA) תורגם עם הגן SC כחלבון היתוך לאחר טרנספקציה פלסמידית, והשאיר אתר תגובתי על פני השטח של OMVs. לאחר ערבוב RBD-ST במערכת חיץ קונבנציונלית בן לילה, נוצר קשירה קוולנטית בין OMVs ו- RBD. כך הושג חיסון OMV רב-ערכי. על ידי החלפה באנטיגנים מגוונים, פלטפורמת החיסון OMVs יכולה להציג ביעילות מגוון אנטיגנים הטרוגניים, ובכך למנוע במהירות מגיפות של מחלות זיהומיות. פרוטוקול זה מתאר שיטה מדויקת לבניית פלטפורמת החיסון OMV, כולל ייצור, טיהור, ביו-קונגציה ואפיון.
Introduction
כפלטפורמת חיסון פוטנציאלית, שלפוחיות הממברנה החיצונית (OMVs) משכו יותר ויותר תשומת לב בשנים האחרונות 1,2. OMVs, המופרשים באופן טבעי בעיקר על ידי חיידקים גראם שליליים3, הם חלקיקים ננומטריים כדוריים המורכבים מדו-שכבת שומנים, בדרך כלל בגודל של 20-300 ננומטר4. OMVs מכילים רכיבים שונים של חיידקי הורים, כולל אנטיגנים חיידקיים ותבניות מולקולריות הקשורות לפתוגנים (PAMPs), המשמשים כפוטנציאטורים חיסוניים מוצקים5. הודות למרכיביהם הייחודיים, מבנה השלפוחית הטבעי ואתרי שינוי נהדרים בהנדסה גנטית, OMVs פותחו לשימוש בתחומים ביו-רפואיים רבים, כולל חיסונים חיידקיים6, אדג’ובנטים7, תרופות אימונותרפיות לסרטן8, וקטורים למתן תרופות9 ודבקים אנטי-בקטריאליים10.
מגיפת SARS-CoV-2, שהתפשטה ברחבי העולם מאז 2020, גבתה מחיר כבד מהחברה העולמית. תחום קשירת הקולטן (RBD) בחלבון ספייק (חלבון S) יכול להיקשר עם אנזים ממיר אנגיוטנסין אנושי 2 (ACE2), אשר לאחר מכן מתווך את כניסת הנגיף לתא11,12,13. לפיכך, נראה כי RBD הוא יעד עיקרי לגילוי חיסונים14,15,16. עם זאת, RBD מונומרי הוא אימונוגני גרוע, והמשקל המולקולרי הקטן שלו מקשה על מערכת החיסון לזהות, ולכן אדג’ובנטים נדרשים לעתים קרובות17.
על מנת להגביר את האימונוגניות של RBD, נבנו OMVs המציגים RBDs רב-ערכיים. מחקרים קיימים המשתמשים ב-OMV להצגת RBD בדרך כלל ממזגים RBD עם OMV כדי להתבטא בחיידקים18. עם זאת, RBD הוא חלבון שמקורו בנגיף, וביטוי פרוקריוטי עשוי להשפיע על פעילותו. כדי לפתור בעיה זו, נעשה שימוש במערכת SpyTag (ST)/SpyCatcher (SC), הנגזרת מ-Streptococcus pyogenes, ליצירת איזופפטיד קוולנטי עם OMV ו-RBD במערכת חיץ קונבנציונלית19. תחום ה-SC בא לידי ביטוי עם ציטוליזין A (ClyA) כחלבון היתוך על ידי קולי Escherichia מהונדס ביולוגית, ו-ST התבטא עם RBD באמצעות מערכת הביטוי התאית HEK293F. OMV-SC ו- RBD-ST היו מעורבים ודוגרו בן לילה. לאחר טיהור על ידי ultracentrifugation או כרומטוגרפיה אי הכללת גודל (SEC), OMV-RBD התקבל.
Protocol
Representative Results
Discussion
כדי ליצור פלטפורמת חיסון ננו-חלקיקים “Plug-and-Display”, ClyA שהתמזגה ב-SC באה לידי ביטוי בזני BL21(DE3), שהוא אחד המודלים הנפוצים ביותר לייצור חלבונים רקומביננטיים בגלל יתרונותיו בביטוי חלבונים24, כך שיהיה מספיק מקטע SC המוצג על פני השטח של ה-OMVs במהלך תהליך התפשטות החיידקים. במקביל, אנטיגן מטר…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המפתח של קרן מדעי הטבע של צ’ונגצ’ינג (לא. cstc2020jcyj-zdxmX0027) ופרויקט הקרן הלאומית הסינית למדעי הטבע (מס’ 31670936, 82041045).
Materials
| Ampicillin sodium | Sangon Biotech | A610028 | |
| Automated cell counter | Countstar | BioTech | |
| BCA protein quantification Kit | cwbio | cw0014s | |
| ChemiDoc Touching Imaging System | Bio-rad | ||
| Danamic Light Scattering | Malvern | Zetasizer Nano S90 | |
| Electrophoresis apparatus | Cavoy | Power BV | |
| EZ-Buffers H 10X TBST Buffer | Sangon Biotech | C520009 | |
| Goat pAb to mouse IgG1 | Abcam | ab97240 | |
| High speed freezing centrifuge | Bioridge | H2500R | |
| His-Tag mouse mAb | Cell signaling technology | 2366s | |
| Imidazole | Sangon Biotech | A600277 | |
| Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside | Sangon Biotech | A600118 | |
| Ni-NTA His-Bind Superflow | Qiagen | 70691 | |
| Non-fat powdered milk | Sangon Biotech | A600669 | |
| OPM-293 cell culture medium | Opm biosciences | 81075-001 | |
| pcDNA3.1 RBD-ST plasmid | Wuhan genecreat biological techenology | ||
| Phosphate buffer saline | ZSGB-bio | ZLI-9061 | |
| Polyethylenimine Linear | Polysciences | 23966-1 | |
| Prestained protein ladder | Thermo | 26616 | |
| pThioHisA ClyA-SC plasmid | Wuhan genecreat biological techenology | ||
| PVDF Western Blotting Membranes | Roche | 03010040001 | |
| Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column) | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE loading buffer (5x) | Beyotime | P0015 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A100241 | |
| Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution) | Thermo | 34577 | |
| Suspension instrument | Life Technology | Hula Mixer | |
| Transmission Electron Microscope | Hitachi | HT7800 | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
| Ultracentrifuge | Beckman coulter | XPN-100 | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Hitachi | U-3900 | |
| Yeast extract | Sangon Biotech | A610961 |
Riferimenti
- Li, M., et al. Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update. Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).
- Micoli, F., MacLennan, C. A. Outer membrane vesicle vaccines. Seminars in Immunology. 50, 101433 (2020).
- Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
- Sartorio, M. G., Pardue, E. J., Feldman, M. F., Haurat, M. F. Bacterial outer membrane vesicles: From discovery to applications. Annual Review of Microbiology. 75, 609-630 (2021).
- Kaparakis-Liaskos, M., Ferrero, R. L. Immune modulation by bacterial outer membrane vesicles. Nature Reviews Immunology. 15 (6), 375-387 (2015).
- Petousis-Harris, H., Radcliff, F. J. Exploitation of Neisseria meningitidis group B OMV vaccines against N-gonorrhoeae to inform the development and deployment of effective gonorrhea vaccines. Frontiers in Immunology. 10, 683 (2019).
- Gnopo, Y. M. D., Watkins, H. C., Stevenson, T. C., DeLisa, M. P., Putnam, D. Designer outer membrane vesicles as immunomodulatory systems – Reprogramming bacteria for vaccine delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 114, 132-142 (2017).
- Zhang, Y. X., Fang, Z. Y., Li, R. Z., Huang, X. T., Liu, Q. Design of outer membrane vesicles as cancer vaccines: A new toolkit for cancer therapy. Cancers. 11 (9), 1314 (2019).
- Berleman, J., Auer, M. The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery. Environmental Microbiology. 15 (2), 347-354 (2013).
- Huang, W. L., Meng, L. X., Chen, Y., Dong, Z. Q., Peng, Q. Bacterial outer membrane vesicles as potential biological nanomaterials for antibacterial therapy. Acta Biomaterialia. 140, 102-115 (2022).
- Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
- Robbiani, D. F., et al. Convergent antibody responses to SARS-CoV-2 in convalescent individuals. Nature. 584 (7821), 437-442 (2020).
- Wang, M. Y., et al. SARS-CoV-2: Structure, Biology, and Structure-Based Therapeutics Development. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269 (2020).
- Yang, S., et al. Safety and immunogenicity of a recombinant tandem-repeat dimeric RBD-based protein subunit vaccine (ZF2001) against COVID-19 in adults: Two randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1 and 2 trials. The Lancet Infectious Disease. 21 (8), 1107-1119 (2021).
- Wang, Z., et al. mRNA vaccine-elicited antibodies to SARS-CoV-2 and circulating variants. Nature. 592 (7855), 616-622 (2021).
- Amanat, F., et al. SARS-CoV-2 mRNA vaccination induces functionally diverse antibodies to NTD, RBD, and S2. Cell. 184 (15), 3936-3948 (2021).
- Tan, H. X., et al. Immunogenicity of prime-boost protein subunit vaccine strategies against SARS-CoV-2 in mice and macaques. Nature Communication. 12 (1), 1403 (2021).
- Thapa, H. B., Mueller, A. M., Camilli, A., Schild, S. An intranasal vaccine based on outer membrane vesicles against SARS-CoV-2. Frontiers in Microbiology. 12, 752739 (2021).
- Ma, X., et al. Nanoparticle vaccines based on the receptor binding domain (RBD) and heptad repeat (HR) of SARS-CoV-2 elicit robust protective immune responses. Immunity. 53 (6), 1315-1330 (2020).
- Yang, Z., et al. RBD-modified bacterial vesicles elicited potential protective immunity against SARS-CoV-2. Nano Letters. 21 (14), 5920-5930 (2021).
- Rhinesmith, T., Killinger, B. A., Sharma, A., Moszczynska, A. Multimer-PAGE: A method for capturing and resolving protein complexes in biological samples. Journal of Visualized Experiments. (123), e55341 (2017).
- Arslan, A., et al. Determining total protein and bioactive protein concentrations in bovine colostrum. Journal of Visualized Experiments. (178), e63001 (2021).
- Alves, N. J., Turner, K. B., Walper, S. A. Directed protein packaging within outer membrane vesicles from Escherichia coli: Design, production and purification. Journal of Visualized Experiments. (117), e54458 (2016).
- Kim, S., et al. Genomic and transcriptomic landscape of Escherichia coli BL21(DE3). Nucleic Acids Research. 45 (9), 5285-5293 (2017).
- Daleke-Schermerhorn, M. H., et al. Decoration of outer membrane vesicles with multiple antigens by using an autotransporter approach. Applied and Environmental Microbiology. 80 (18), 5854-5865 (2014).
- Kuipers, K., et al. Salmonella outer membrane vesicles displaying high densities of pneumococcal antigen at the surface offer protection against colonization. Vaccine. 33 (17), 2022-2029 (2015).
- Veggiani, G., et al. Programmable polyproteams built using twin peptide superglues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).
- Saunders, K. O., et al. Neutralizing antibody vaccine for pandemic and pre-emergent coronaviruses. Nature. 594, 553-559 (2021).
- van Saparoea, H. B. V., Houben, D., Kuijl, C., Luirink, J., Jong, W. S. P. Combining protein ligation systems to expand the functionality of semi-synthetic outer membrane vesicle nanoparticles. Frontiers in Microbiology. 11, 890 (2020).
- Needham, B. D., et al. Modulating the innate immune response by combinatorial engineering of endotoxin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1464-1469 (2013).
- Zanella, I., et al. Proteome-minimized outer membrane vesicles from Escherichia coli as a generalized vaccine platform. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (4), 12066 (2021).
- Wang, J. L., et al. Truncating the structure of lipopolysaccharide in Escherichia coli can effectively improve poly-3-hydroxybutyrate production. ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1201-1215 (2020).
- Liu, Q., et al. Outer membrane vesicles from flagellin-deficient Salmonella enterica serovar Typhimurium induce cross-reactive immunity and provide cross-protection against heterologous Salmonella challenge. Scientific Reports. 6, 34776 (2016).
- Balhuizen, M. D., Veldhuizen, E. J. A., Haagsman, H. P. Outer membrane vesicle induction and isolation for vaccine development. Frontiers in Microbiology. 12, 629090 (2021).
- Hua, L., et al. A novel immunomodulator delivery platform based on bacterial biomimetic vesicles for enhanced antitumor immunity. Advanced Materials. 33 (43), 2103923 (2021).
