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Bioingegneria

SARS-CoV-2受容体結合ドメインを示す外膜小胞に基づく「プラグアンドディスプレイ」ナノ粒子ワクチンプラットフォーム

Published: July 25, 2022
doi:
10.3791/64213
, , , , , ,
1National Engineering Research Center of Immunological Products, Department of Microbiology and Biochemical Pharmacy, College of Pharmacy,Third Military Medical University

Summary

本プロトコルは、外膜小胞のバイオエンジニアリングを、生産、精製、バイオコンジュゲーション、および特性評価を含む「プラグアンドディスプレイ」ワクチンプラットフォームとして説明しています。

Abstract

細菌またはウイルスから得られる生体模倣ナノ粒子は、ワクチンの研究開発において大きな関心を集めている。外膜小胞(OMV)は、平均的な成長中に主にグラム陰性菌によって分泌され、ナノサイズの直径と自己アジュバント活性を持ち、ワクチンの送達に理想的である可能性があります。OMVは、タンパク質、核酸、および低分子の多面的な送達システムとして機能してきました。OMVの生物学的特性を最大限に活用するために、バイオエンジニアリングされた 大腸菌由来のOMVをキャリアとして、SARS-CoV-2受容体結合ドメイン(RBD)を抗原として利用して、「プラグアンドディスプレイ」ワクチンプラットフォームを構築しました。 化膿レンサ 球菌のスパイキャッチャー(SC)ドメインとスパイタグ(ST)ドメインをコンジュゲートOMVとRBDに適用しました。Cytolysin A(ClyA)遺伝子は、プラスミドトランスフェクション後に融合タンパク質としてSC遺伝子とともに翻訳され、OMVの表面に反応部位を残しました。従来のバッファーシステムでRBD-STを一晩混合した後、OMVとRBDの間に共有結合を形成しました。このようにして、多価表示OMVワクチンが達成された。OMVワクチンプラットフォームは、多様な抗原に置き換えることで、さまざまな不均一な抗原を効率的に表示できるため、感染症の流行を迅速に防ぐことができます。このプロトコルは、生産、精製、バイオコンジュゲーション、および特性評価を含む、OMVワクチンプラットフォームを構築するための正確な方法を説明しています。

Introduction

潜在的なワクチンプラットフォームとして、外膜小胞(OMV)は近年ますます注目を集めています1,2。主にグラム陰性菌3によって自然に分泌されるOMVは、通常20〜300nmのサイズの脂質二重層で構成される球状のナノスケール粒子です4。OMVには、細菌抗原や病原体関連分子パターン(PAMP)など、固形免疫増強因子として機能するさまざまな親細菌成分が含まれています5。OMVは、そのユニークな成分、自然な小胞構造、および優れた遺伝子工学修飾部位の恩恵を受けて、細菌ワクチン6、アジュバント7、癌免疫療法薬8、薬物送達ベクター9、および抗菌接着剤10を含む多くの生物医学分野で使用するために開発されてきました。

2020年以降世界中に広がったSARS-CoV-2のパンデミックは、グローバル社会に大きな打撃を与えました。スパイクタンパク質(Sタンパク質)の受容体結合ドメイン(RBD)は、ヒトアンジオテンシン変換酵素2(ACE2)と結合することができ、次いで、細胞へのウイルスの侵入を媒介する11、12、13。したがって、RBDはワクチン発見の主要な標的であるように思われます14,15,16。しかし、単量体RBDは免疫原性が低く、分子量が小さいため免疫系が認識しにくいため、アジュバントが必要になることがよくあります17。

RBDの免疫原性を高めるために、多価RBDを示すOMVを構築した。RBDを表示するためにOMVを使用する既存の研究は、通常、RBDをOMVと融合させて細菌で発現させます18。しかし、RBDはウイルス由来のタンパク質であり、原核生物の発現はその活性に影響を与える可能性があります。この問題を解決するために、 化膿レンサ球菌由来のSpyTag(ST)/SpyCatcher(SC)系を用いて、従来の緩衝系においてOMVおよびRBDと共有結合性イソペプチドを形成した19。SCドメインは、バイオエンジニアリングされた 大腸菌による融合タンパク質としてCytolysin A(ClyA)で発現し、STはHEK293F細胞発現系を介してRBDで発現しました。OMV-SCとRBD-STを混合し、一晩インキュベートしました。超遠心またはサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)による精製後、OMV-RBDが得られた。

Protocol

1. プラスミド構築 SpyCatcher配列をコードするDNA(補足ファイル1)を、BamH IサイトとSal Iサイトの間のアンピシリン耐性pThioHisA-ClyAプラスミド(材料表を参照)に挿入し、以前に発表された第20相に続いてプラスミドpThioHisA ClyA-SCを構築します。 合成したSpyTag-RBD-Histag融合遺伝子(補足ファイル1)を、BamH Iサイトと…

Representative Results

このプロトコルのフローチャートを 図 1 に示します。このプロトコルは、OMVをワクチンプラットフォームとして利用するための一般的なアプローチである可能性があります。抗原の種類に基づいて適切な発現システムを選択するだけで済みます。 図2は、実現可能なプラスミド設計スキームを示しています。SC遺伝子はフレキ?…

Discussion

「プラグアンドディスプレイ」ナノ粒子ワクチンプラットフォームを作成するために、SC融合ClyAは、タンパク質発現24の利点のために組換えタンパク質生産に最も広く使用されているモデルの1つであるBL21(DE3)株で発現され、細菌増殖の過程でOMVの表面に十分なSCフラグメントが表示されます。同時に、抗原とOMVの間の化学的カップリングのためにST融合標的抗原を調製した。…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作業は、重慶自然科学基金会の主要プログラム(No.cstc2020jcyj-zdxmX0027)および中国国家自然科学財団プロジェクト(第31670936号、82041045)。

Materials

Ampicillin sodium Sangon Biotech A610028
Automated cell counter Countstar BioTech
BCA protein quantification Kit cwbio cw0014s
ChemiDoc Touching Imaging System Bio-rad
Danamic Light Scattering Malvern Zetasizer Nano S90
Electrophoresis apparatus Cavoy Power BV
EZ-Buffers H 10X TBST Buffer Sangon Biotech C520009
Goat pAb to mouse IgG1 Abcam ab97240
High speed freezing centrifuge Bioridge H2500R
His-Tag mouse mAb Cell signaling technology 2366s
Imidazole Sangon Biotech A600277
Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Sangon Biotech A600118
Ni-NTA His-Bind Superflow Qiagen 70691
Non-fat powdered milk Sangon Biotech A600669
OPM-293 cell culture medium Opm biosciences 81075-001
pcDNA3.1 RBD-ST plasmid Wuhan genecreat biological techenology
Phosphate buffer saline ZSGB-bio ZLI-9061
Polyethylenimine Linear Polysciences 23966-1
Prestained protein ladder Thermo 26616
pThioHisA ClyA-SC plasmid Wuhan genecreat biological techenology
PVDF Western Blotting Membranes Roche 03010040001
Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column) GE healthcare
SDS-PAGE loading buffer (5x) Beyotime P0015
Sodium chloride Sangon Biotech A100241
Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution) Thermo 34577
Suspension instrument Life Technology Hula Mixer
Transmission Electron Microscope Hitachi HT7800
Tryptone Oxoid LP0042B
Ultracentrifuge Beckman coulter XPN-100
Ultraviolet spectrophotometer Hitachi U-3900
Yeast extract Sangon Biotech A610961
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Riferimenti

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Keywords: Nanoparticle VaccineOuter Membrane VesiclesSARS-CoV-2 Receptor-binding DomainAntigen DisplayCytolysin A SpycatcherOMV Spycatcher ProductionOMV Spycatcher PurificationRBD Spytag TransfectionEukaryotic Expression System
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Citazione di questo articolo
Feng, R., Li, G., Jing, H., Liu, C., Xue, R., Zou, Q., Li, H. A “Plug-And-Display” Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain. J. Vis. Exp. (185), e64213, doi:10.3791/64213 (2022).
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