In vivo Luminale meting van Distensie-evoked Urothelial ATP Release bij knaagdieren
Summary
Dit protocol beschrijft de procedure voor het meten van ATP-concentraties in het lumen van de blaas bij een verdoofd knaagdier.
Abstract
ATP, vrijgekomen uit het urotheel als reactie op opgezette blaas, wordt verondersteld een belangrijke sensorische rol te spelen bij de controle van mictie. Daarom is nauwkeurige meting van urotheliale ATP-afgifte in een fysiologische omgeving een belangrijke eerste stap in het bestuderen van de mechanismen die purinerge signalering in de urineblaas regelen. Bestaande technieken om mechanisch opgeroepen urotheliale ATP-afgifte te bestuderen, maken gebruik van gekweekte cellen die zijn verguld op flexibele steunen of blaasweefsel dat in ussingkamers is vastgepind; elk van deze technieken emuleert echter niet volledig de omstandigheden in de intacte blaas. Daarom werd een experimentele opstelling ontwikkeld om atp-concentraties direct te meten in het lumen van de urineblaas van knaagdieren.
In deze opstelling worden de blazen van verdoofde knaagdieren door katheters in zowel de koepel van de blaas als via de externe urethrale opening doordrenkt. De druk in de blaas wordt verhoogd door de urethrale katheter af te sluiten en steriele vloeistof via de koepel in de blaas te brengen. Meting van de intravesicale druk wordt bereikt met behulp van een drukomvormer die is bevestigd aan de blaaskoepelkatheter, vergelijkbaar met de opstelling die wordt gebruikt voor cystometrie. Zodra de gewenste druk is bereikt, wordt de dop van de urethrale katheter verwijderd en vloeistof verzameld voor ATP-kwantificering door luciferine-luciferasetest. Door deze experimentele opstelling kunnen de mechanismen die zowel mechanische als chemische stimulatie van urotheliale ATP-afgifte regelen, worden ondervraagd door verschillende agonisten of antagonisten in het perfusaat op te nemen of door resultaten tussen wildtype en genetisch gemodificeerde dieren te vergelijken.
Introduction
Urinaire ATP wordt verondersteld een belangrijke sensorische rol te spelen bij de controle van mictie1. Er wordt bijvoorbeeld gedacht dat ATP wordt vrijgegeven uit het urotheel als reactie op uitzetting, waar het kan inwerken op receptoren op blaasafferente zenuwen om hun prikkelbaarheid te vergroten, wat leidt tot sensaties van volheid2. Er wordt dus ook gedacht dat urine-ATP een belangrijke speler kan zijn in de ontwikkeling van blaaspathologieën. Ter ondersteuning van deze hypothese zijn de ATP-concentraties in de urine significant verhoogd bij patiënten die lijden aan een overactieve blaas (OAB)3, blaaspijnsyndroom/interstitiële cystitis (BPS/IC)4, of een urineweginfectie (UTI)5,6, allemaal aandoeningen die worden gekenmerkt door verhoogde urgentie, frequentie en soms pijn. Omgekeerd is aangetoond dat patiënten die lijden aan een onderactieve blaas (UAB), die wordt gekenmerkt door een onvermogen om de blaas te legen en soms een verminderd vermogen kan hebben om blaasvolheid te voelen, verlaagde ATP-concentraties in de urine hebben7. Experimenteel kan manipulatie van ATP-concentraties in de urine de blaasreflexen bij de rat veranderen; het verhogen van ATP-concentraties door het blokkeren van endogene ATPasen in het blaaslumen kan de leegtefrequentie verhogen, terwijl het verlagen van ATP-concentraties door exogene ATPasen in de blaas te brengen de ledigingsfrequentie vermindert8. Het belang van urine-ATP voor de blaasfunctie is dus duidelijk.
Gezien het schijnbare belang van atp in de urine voor blaaspathologie, is nauwkeurige meting van urotheliale ATP-afgifte een belangrijke stap in het begrijpen van de mechanismen die de afgifte regelen. Veel studies zijn voltooid met behulp van verschillende experimentele modellen om de afgifte van urotheliale ATP te meten. De belangrijkste hiervan zijn celculturen, primaire culturen of cellijnen. Het gebruik van gekweekte urotheelcellen wordt echter bemoeilijkt door het feit dat urotheelcellen hun fysiologische gepolariseerde morfologie niet aannemen, tenzij ze worden gekweekt op speciale permeabele membranen (zoals Transwell-technologie [putinzet])9. Het is dus moeilijk om een ATP-afgifte gemeten te relateren aan de fysiologie. Urotheelcellen gekweekt op putinzetstukken kunnen polariseren en een barrière vormen die lijkt op wat in vivo wordt gezien; de groei van een volledig gedifferentieerd urotheel kan echter dagen of weken duren. Bovendien, hoewel het mogelijk is om putinzetstukken in een ussingkamer te monteren en druk uit te oefenen op de apicale kant om rek te veroorzaken, is het moeilijk om voldoende druk uit te oefenen om de omstandigheden in de blaas na te bootsen tijdens pathologie (d.w.z. drukken van 30 cm H2O of hoger). Heel blaasweefsel kan ook in een Ussing-kamer worden gemonteerd voor stretchexperimenten, maar dit verwijdert de blaas uit het organisme samen met de trofische factoren die de gezondheid van de urotheelcel en dus de urotheliale barrièrefunctie behouden. Daarom is de meest fysiologisch relevante manier om de afgifte van ATP uit het urotheel te bestuderen als reactie op rek of druk in vivo. De chirurgische technieken die nodig zijn om het experiment op te zetten, zijn identiek aan die welke vaak worden gebruikt in de cystometrie bij dieren en moeten daarom gemakkelijk kunnen worden uitgevoerd door iedereen die bekend is met die techniek.
In dit protocol zullen we de techniek beschrijven die wordt gebruikt om luminale ATP te onderzoeken bij vrouwelijke Sprague Dawley-ratten met een gewicht van ongeveer 200-250 g, omdat de hieronder beschreven transurethrale katheterisatie veel gemakkelijker is bij vrouwen; transurethrale katheterisatie kan echter ook worden uitgevoerd bij mannelijke knaagdieren10. Aangezien transurethrale katheterisatie nu is uitgevoerd bij muizen van beide geslachtenen ook 11, kunnen deze experimenten gemakkelijk worden aangepast voor muizen of ratten van beide geslachten of van verschillende grootte, afhankelijk van de behoeften van het onderzoeksteam.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het grootste deel van het onderzoek naar urotheliale ATP-afgifte wordt uitgevoerd in gekweekte cellen, met behulp van onsterfelijke cellijnen of primaire culturen van knaagdierurotheelcellen. Hoewel deze modellen het voordeel hebben dat ze een relatief hoge doorvoersnelheid hebben (d.w.z. één cultuur / passage kan veel platen / schotels van cellen maken), wordt hun fysiologische relevantie verminderd als gevolg van: 1) het onvermogen van urotheelcellen om gepolariseerd te groeien tenzij ze op speciale steunen worden ge…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van het National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) aan JMB (DK117884).
Materials
| amplifier | World Precision Instruments (WPI) | SYS-TBM4M | |
| ATP assay kit | Sigma-Aldrich, Inc. | FLAA-1KT | |
| data acquisition system/ software | DataQ Instruments | DI-1100 | Software included, requires Windows-based computer |
| Hexamethonium bromide | Sigma-Aldrich, Inc. | H0879 | 20 mg/kg dose |
| Isoflurane | Covetrus North America | 29404 | |
| lidocaine | Covetrus North America | 2468 | |
| Luer Lock plugs | Fisher Scientific | NC0455253 | |
| luminometer (GloMax 20/20) | Promega | E5311 | |
| Polyethylene (PE50) tubing | Fisher Scientific | 14-170-12B | |
| Pump 33 DDS syringe pump | Harvard Apparatus | 703333 | |
| pressure transducers | World Precision Instruments (WPI) | BLPR2 | |
| surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.) | Fine Science Tools | multiple numbers | |
| surgical lubricant | Fisher Scientific | 10-000-694 | |
| Sur-Vet I.V. catheter | Covetrus North America | 50603 | 20 G x 1 inch |
| tiltable surgical table (Plas Labs) | Fisher Scientific | 01-288-30A | |
| Tubing connectors | Fisher Scientific | 14-826-19E | allows Luer-Lock connectors to attach to tubing |
| Urethane | Sigma-Aldrich, Inc. | U2500 | 0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose |
Riferimenti
- Burnstock, G. Purinergic signalling in the urinary tract in health and disease. Purinergic Signalling. 10 (1), 103-155 (2014).
- Birder, L. A. Urothelial signaling. Autonomic Neuroscience: Basic & Clinical. 153 (1-2), 33-40 (2010).
- Silva-Ramos, M., et al. Urinary ATP may be a dynamic biomarker of detrusor overactivity in women with overactive bladder syndrome. PLoS One. 8 (5), 64696 (2013).
- Sun, Y., Chai, T. C. Augmented extracellular ATP signaling in bladder urothelial cells from patients with interstitial cystitis. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 290 (1), 27-34 (2006).
- Gill, K., et al. Urinary ATP as an indicator of infection and inflammation of the urinary tract in patients with lower urinary tract symptoms. BMC Urology. 15 (1), 7 (2015).
- Säve, S., Persson, K. Extracellular ATP and P2Y receptor activation induce a proinflammatory host response in the human urinary tract. Infection and Immunity. 78 (8), 3609-3615 (2010).
- Munoz, A., Smith, C. P., Boone, T. B., Somogyi, G. T. Overactive and underactive bladder dysfunction is reflected by alterations in urothelial ATP and NO release. Neurochemistry International. 58 (3), 295-300 (2011).
- Beckel, J. M., et al. Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder. The Journal of Physiology. 593 (8), 1857-1871 (2015).
- Zhang, Y. Y., Ludwikowski, B., Hurst, R., Frey, P. Expansion and long-term culture of differentiated normal rat urothelial cells in vitro. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 37 (7), 419-429 (2001).
- Lee, S., Carrasco, A., Meacham, R. B., Malykhina, A. P. Transurethral instillation procedure in adult male mouse. Journal of Visualized Experiments. (129), e56663 (2017).
- Zychlinsky Scharff, A., Albert, M. L., Ingersoll, M. A. Urinary tract infection in a small animal model: Transurethral catheterization of male and female mice. Journal of Visualized Experiments. (130), e54432 (2017).
- Uvin, P., et al. The use of cystometry in small rodents: a study of bladder chemosensation. Journal of Visualized Experiments. (66), e3869 (2012).
- Leitao, J. M., Esteves da Silva, J. C. Firefly luciferase inhibition. Journal of Photochemistry and Photobiology B. 101 (1), 1-8 (2010).
- Auld, D. S., Thorne, N., Nguyen, D. T., Inglese, J. A specific mechanism for nonspecific activation in reporter-gene assays. ACS Chemical Biology. 3 (8), 463-470 (2008).
- Harvey, E. N. Studies on the oxidation of luciferin without luciferase and the mechanism of bioluminescence. Journal of Biological Chemistry. 78 (2), 369-375 (1928).
- Wang, J., Jackson, D. G., Dahl, G. The food dye FD&C Blue No. 1 is a selective inhibitor of the ATP release channel Panx1. The Journal of General Physiology. 141 (5), 649-656 (2013).
- Avazpour, M., Shiri, S., Delpisheh, A., Abbasi, A. M. Simultaneous determination of brilliant blue FCF and carmoisine in food samples by aqueous two-phase system and spectrophometric detection. Journal of Basic Research in Medical Sciences. 1 (1), 56-65 (2014).
