In vivo Luminal måling af distension-fremkaldt urothelial ATP-frigivelse hos gnavere
Summary
Denne protokol beskriver proceduren til måling af ATP-koncentrationer i blærens lumen i en bedøvet gnaver.
Abstract
ATP, frigivet fra urothelium som reaktion på blæreudspiling, menes at spille en væsentlig sensorisk rolle i kontrollen af mikturering. Derfor er nøjagtig måling af urothelial ATP-frigivelse i en fysiologisk indstilling et vigtigt første skridt i at studere de mekanismer, der styrer purinerg signalering i urinblæren. Eksisterende teknikker til at studere mekanisk fremkaldt urothelial ATP-frigivelse udnytter dyrkede celler belagt på fleksible understøtninger eller blærevæv fastgjort i Ussing-kamre; Imidlertid efterligner hver af disse teknikker ikke fuldt ud forholdene i den intakte blære. Derfor blev der udviklet en eksperimentel opsætning til direkte måling af ATP-koncentrationer i lumen i gnaverurinblæren.
I denne opsætning perfuseres blærerne af bedøvede gnavere gennem katetre i både blærens kuppel og via den ydre urinrørsåbning. Trykket i blæren øges ved at dække urinrørets kateter, mens steril væske perfuseres ind i blæren gennem kuplen. Måling af intravesikalt tryk opnås ved hjælp af en tryktransducer, der er fastgjort til blærekuppelkateteret, svarende til den opsætning, der anvendes til cystometri. Når det ønskede tryk er nået, fjernes urinrørets kateterhætte, og væske opsamles til ATP-kvantificering ved luciferin-luciferase-assay. Gennem denne eksperimentelle opsætning kan mekanismerne, der styrer både mekanisk og kemisk stimulering af urothelial ATP-frigivelse, undersøges ved at inkludere forskellige agonister eller antagonister i perfusatet eller ved at sammenligne resultater mellem vildtype og genetisk modificerede dyr.
Introduction
Urin ATP menes at spille en væsentlig sensorisk rolle i kontrollen af mikturering1. For eksempel menes det, at ATP frigives fra urothelium som reaktion på distension, hvor det kan virke på receptorer på blæreafferente nerver for at øge deres excitabilitet, hvilket fører til fornemmelser af fylde2. Således menes det også, at urin-ATP kan være en vigtig aktør i udviklingen af blærepatologier. Til støtte for denne hypotese øges ATP-koncentrationerne i urinen signifikant hos patienter, der lider af overaktiv blære (OAB)3, blærepinesyndrom/interstitiel cystitis (BPS/IC)4 eller en urinvejsinfektion (UTI)5,6, alle tilstande karakteriseret ved øget haster, hyppighed og undertiden smerte. Omvendt har patienter, der lider af underaktiv blære (UAB), som er karakteriseret ved manglende evne til at tømme blæren og undertiden kan omfatte en nedsat evne til at mærke blærens fylde, vist sig at have nedsat ATP-koncentrationer i urinen7. Eksperimentelt kan manipulation af ATP-koncentrationer i urinen ændre blærereflekser hos rotten; stigende ATP-koncentrationer ved at blokere endogene ATPaser i blærens lumen kan øge tømningsfrekvensen, mens faldende ATP-koncentrationer ved at indføre eksogene ATPaser i blæren reducerer tømningsfrekvensen8. Således er betydningen af urin ATP til blærefunktion klar.
I betragtning af den tilsyneladende betydning af urin-ATP for blærepatologi er nøjagtig måling af urothelial ATP-frigivelse et vigtigt skridt i forståelsen af de mekanismer, der styrer frigivelsen. Mange undersøgelser er afsluttet ved hjælp af forskellige eksperimentelle modeller til måling af urothelial ATP-frigivelse. Først og fremmest blandt disse er cellekulturer, enten primære kulturer eller cellelinjer. Imidlertid kompliceres brugen af dyrkede urothelceller af det faktum, at urothelceller ikke påtager sig deres fysiologiske polariserede morfologi, medmindre de dyrkes på specielle permeable membraner (såsom Transwell-teknologi [brøndindsatser])9. Det er således vanskeligt at relatere enhver ATP-frigivelse målt til fysiologi. Urotelceller dyrket på brøndindsatser kan polarisere og danne en barriere, der ligner det, der ses in vivo; Imidlertid kan væksten af et fuldt differentieret urothelium tage dage eller uger. Derudover, mens det er muligt at montere brøndindsatser i et Ussing-kammer og lægge pres på den apikale side for at forårsage strækning, er det vanskeligt at anvende tilstrækkeligt tryk til at efterligne tilstande inde i blæren under patologi (dvs. tryk på 30 cm H2O eller derover). Hele blærevæv kan også monteres i et Ussing-kammer til strækforsøg, men dette fjerner blæren fra organismen sammen med de trofiske faktorer, der opretholder urothelialcellesundhed og dermed urothelial barrierefunktion. Derfor er den mest fysiologisk relevante måde at studere frigivelsen af ATP fra urothelium som reaktion på strækning eller tryk in vivo. De kirurgiske teknikker, der er nødvendige for at gennemføre forsøget, er identiske med dem, der almindeligvis anvendes i dyrecystometri, og bør derfor let udføres af alle, der er fortrolige med denne teknik.
I denne protokol vil vi beskrive den teknik, der anvendes til at undersøge luminal ATP hos kvindelige Sprague Dawley-rotter, der vejer ca. 200-250 g, da den transurethrale kateterisering beskrevet nedenfor er meget lettere hos kvinder; Imidlertid kan transuretral kateterisering også udføres hos mandlige gnavere10. Da transuretral kateterisering nu også er udført på mus af begge køn11, kan disse eksperimenter let tilpasses mus eller rotter af begge køn eller af varierende størrelse afhængigt af forskerholdets behov.
Protocol
Representative Results
Discussion
Størstedelen af forskningen i urothelial ATP-frigivelse udføres i dyrkede celler ved hjælp af enten udødeliggjorte cellelinjer eller primære kulturer af gnaverurothelceller . Mens disse modeller har fordelen ved at være relativt høj gennemstrømning (dvs. en kultur / passage kan lave mange plader / skåle af celler), mindskes deres fysiologiske relevans på grund af: 1) urothelcellers manglende evne til at vokse polariseret, medmindre de dyrkes på specielle understøtninger og 2) vanskeligheden ved at udsætte dy…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra Statens Institut for Diabetes og Fordøjelses- og Nyresygdomme (NIDDK) til JMB (DK117884).
Materials
| amplifier | World Precision Instruments (WPI) | SYS-TBM4M | |
| ATP assay kit | Sigma-Aldrich, Inc. | FLAA-1KT | |
| data acquisition system/ software | DataQ Instruments | DI-1100 | Software included, requires Windows-based computer |
| Hexamethonium bromide | Sigma-Aldrich, Inc. | H0879 | 20 mg/kg dose |
| Isoflurane | Covetrus North America | 29404 | |
| lidocaine | Covetrus North America | 2468 | |
| Luer Lock plugs | Fisher Scientific | NC0455253 | |
| luminometer (GloMax 20/20) | Promega | E5311 | |
| Polyethylene (PE50) tubing | Fisher Scientific | 14-170-12B | |
| Pump 33 DDS syringe pump | Harvard Apparatus | 703333 | |
| pressure transducers | World Precision Instruments (WPI) | BLPR2 | |
| surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.) | Fine Science Tools | multiple numbers | |
| surgical lubricant | Fisher Scientific | 10-000-694 | |
| Sur-Vet I.V. catheter | Covetrus North America | 50603 | 20 G x 1 inch |
| tiltable surgical table (Plas Labs) | Fisher Scientific | 01-288-30A | |
| Tubing connectors | Fisher Scientific | 14-826-19E | allows Luer-Lock connectors to attach to tubing |
| Urethane | Sigma-Aldrich, Inc. | U2500 | 0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose |
Riferimenti
- Burnstock, G. Purinergic signalling in the urinary tract in health and disease. Purinergic Signalling. 10 (1), 103-155 (2014).
- Birder, L. A. Urothelial signaling. Autonomic Neuroscience: Basic & Clinical. 153 (1-2), 33-40 (2010).
- Silva-Ramos, M., et al. Urinary ATP may be a dynamic biomarker of detrusor overactivity in women with overactive bladder syndrome. PLoS One. 8 (5), 64696 (2013).
- Sun, Y., Chai, T. C. Augmented extracellular ATP signaling in bladder urothelial cells from patients with interstitial cystitis. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 290 (1), 27-34 (2006).
- Gill, K., et al. Urinary ATP as an indicator of infection and inflammation of the urinary tract in patients with lower urinary tract symptoms. BMC Urology. 15 (1), 7 (2015).
- Säve, S., Persson, K. Extracellular ATP and P2Y receptor activation induce a proinflammatory host response in the human urinary tract. Infection and Immunity. 78 (8), 3609-3615 (2010).
- Munoz, A., Smith, C. P., Boone, T. B., Somogyi, G. T. Overactive and underactive bladder dysfunction is reflected by alterations in urothelial ATP and NO release. Neurochemistry International. 58 (3), 295-300 (2011).
- Beckel, J. M., et al. Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder. The Journal of Physiology. 593 (8), 1857-1871 (2015).
- Zhang, Y. Y., Ludwikowski, B., Hurst, R., Frey, P. Expansion and long-term culture of differentiated normal rat urothelial cells in vitro. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 37 (7), 419-429 (2001).
- Lee, S., Carrasco, A., Meacham, R. B., Malykhina, A. P. Transurethral instillation procedure in adult male mouse. Journal of Visualized Experiments. (129), e56663 (2017).
- Zychlinsky Scharff, A., Albert, M. L., Ingersoll, M. A. Urinary tract infection in a small animal model: Transurethral catheterization of male and female mice. Journal of Visualized Experiments. (130), e54432 (2017).
- Uvin, P., et al. The use of cystometry in small rodents: a study of bladder chemosensation. Journal of Visualized Experiments. (66), e3869 (2012).
- Leitao, J. M., Esteves da Silva, J. C. Firefly luciferase inhibition. Journal of Photochemistry and Photobiology B. 101 (1), 1-8 (2010).
- Auld, D. S., Thorne, N., Nguyen, D. T., Inglese, J. A specific mechanism for nonspecific activation in reporter-gene assays. ACS Chemical Biology. 3 (8), 463-470 (2008).
- Harvey, E. N. Studies on the oxidation of luciferin without luciferase and the mechanism of bioluminescence. Journal of Biological Chemistry. 78 (2), 369-375 (1928).
- Wang, J., Jackson, D. G., Dahl, G. The food dye FD&C Blue No. 1 is a selective inhibitor of the ATP release channel Panx1. The Journal of General Physiology. 141 (5), 649-656 (2013).
- Avazpour, M., Shiri, S., Delpisheh, A., Abbasi, A. M. Simultaneous determination of brilliant blue FCF and carmoisine in food samples by aqueous two-phase system and spectrophometric detection. Journal of Basic Research in Medical Sciences. 1 (1), 56-65 (2014).
