생체 내 설치류에서 팽창 유발 요로 상피 ATP 방출의 내강 측정
Summary
이 프로토콜은 마취 된 설치류에서 방광 내강의 ATP 농도를 측정하는 절차를 설명합니다.
Abstract
방광 팽창에 반응하여 요로 상피에서 방출되는 ATP는 배뇨 조절에 중요한 감각 역할을하는 것으로 생각됩니다. 따라서 생리학적 환경에서 요로상피 ATP 방출을 정확하게 측정하는 것은 방광에서 청도성 신호 전달을 제어하는 메커니즘을 연구하는 중요한 첫 번째 단계입니다. 기계적으로 유발 된 요로 상피 ATP 방출을 연구하는 기존 기술은 Ussing 챔버에 고정 된 유연한 지지체 또는 방광 조직에 도금 된 배양 세포를 활용합니다. 그러나 이러한 각 기술은 손상되지 않은 방광의 상태를 완전히 모방하지 않습니다. 따라서 설치류 방광의 내강에서 ATP 농도를 직접 측정하기위한 실험 설정이 개발되었습니다.
이 설정에서 마취 된 설치류의 방광은 방광의 돔과 외부 요도 구멍을 통해 카테터를 통해 관류됩니다. 방광의 압력은 요도 카테터를 덮는 동시에 멸균 유체를 돔을 통해 방광으로 관류함으로써 증가합니다. 방광 내 압력 측정은 방광 돔 카테터에 부착 된 압력 변환기를 사용하여 이루어지며, 방광 측정에 사용되는 설정과 유사합니다. 원하는 압력에 도달하면 요도 카테터의 캡을 제거하고 루시페린-루시페라아제 분석에 의해 ATP 정량화를 위해 유체를 수집합니다. 이 실험 설정을 통해 요로 상피 ATP 방출의 기계적 및 화학적 자극을 제어하는 메커니즘은 관류에 다양한 작용제 또는 길항제를 포함하거나 야생형과 유전자 변형 동물 간의 결과를 비교하여 조사 할 수 있습니다.
Introduction
비뇨기 ATP는 배뇨1의 조절에 중요한 감각적 역할을 하는 것으로 생각됩니다. 예를 들어, ATP는 방광 구 심성 신경의 수용체에 작용하여 흥분성을 증가시켜 충만감을 유발할 수있는 팽창에 반응하여 요로 상피에서 방출되는 것으로 생각됩니다2. 따라서 비뇨기 ATP는 방광 병리의 발달에 중요한 역할을 할 수 있다고 생각됩니다. 이 가설을 뒷받침하기 위해 과민성 방광(OAB)3, 방광 통증 증후군/간질성 방광염(BPS/IC)4 또는 요로 감염(UTI)5,6을 앓고 있는 환자에서 요중 ATP 농도가 유의하게 증가하며, 모든 상태는 긴급성, 빈도 및 때로는 통증 증가를 특징으로 합니다. 반대로, 방광을 비울 수 없고 때때로 방광 충만감을 감지하는 능력이 감소할 수 있는 저활동성 방광(UAB)을 앓고 있는 환자는 소변 ATP 농도가 감소한 것으로나타났습니다7. 실험적으로 소변 ATP 농도를 조작하면 쥐의 방광 반사가 바뀔 수 있습니다. 방광 내강에서 내인성 ATPase를 차단하여 ATP 농도를 높이면 배뇨 빈도가 증가할 수 있는 반면, 외인성 ATPase를 방광에 주입하여 ATP 농도를 낮추면 배뇨 빈도가 감소합니다8. 따라서 방광 기능에 대한 비뇨기 ATP의 중요성은 분명합니다.
방광 병리학에 대한 비뇨기 ATP의 명백한 중요성을 감안할 때, 요로 상피 ATP 방출의 정확한 측정은 방출을 제어하는 메커니즘을 이해하는 데 중요한 단계입니다. 요로 상피 ATP 방출을 측정하기 위해 다양한 실험 모델을 사용하여 많은 연구가 완료되었습니다. 이들 중 가장 중요한 것은 1 차 배양 또는 세포주 중 하나 인 세포 배양입니다. 그러나 배양된 요로상피 세포의 사용은 요로상피 세포가 특수 투과성 막(예: Transwell 기술[웰 인서트])에서 성장하지 않는 한 생리학적 분극 형태를 취하지 않는다는 사실로 인해 복잡합니다.9. 따라서, 측정된 임의의 ATP 방출을 생리학과 연관시키는 것은 어렵다. 웰 삽입물에서 성장한 요로 상피 세포는 분극화되어 생체 내에서 볼 수있는 것과 유사한 장벽을 형성 할 수 있습니다. 그러나 완전히 분화 된 요로 상피의 성장에는 며칠 또는 몇 주가 걸릴 수 있습니다. 추가적으로, 웰 인서트를 Ussing 챔버에 장착하고 정점 측에 압력을 가하여 스트레칭을 유발할 수 있지만, 병리학 동안 방광 내부의 조건(즉, 30cmH2O이상의 압력)을 모방하기에 충분한 압력을 가하는 것은 어렵다. 전체 방광 조직은 스트레치 실험을 위해 Ussing 챔버에 장착 할 수도 있지만, 이는 요로 상피 세포 건강 및 요로 상피 장벽 기능을 유지하는 영양 인자와 함께 유기체에서 방광을 제거합니다. 따라서 스트레칭이나 압력에 반응하여 요로 상피에서 ATP의 방출을 연구하는 가장 생리 학적으로 관련된 방법은 생체 내입니다. 실험을 설정하는 데 필요한 수술 기술은 동물 방광 측정술에서 일반적으로 사용되는 것과 동일하므로 해당 기술에 익숙한 사람이라면 누구나 쉽게 수행 할 수 있어야합니다.
이 프로토콜에서는 아래에 설명 된 경 요도 카테터 삽입이 암컷에서 훨씬 쉽기 때문에 체중이 약 200-250g 인 암컷 Sprague Dawley 쥐에서 내강 ATP를 검사하는 데 사용되는 기술을 설명합니다. 그러나, 경요도 카테터 삽입은 또한 수컷 설치류10에서 수행될 수 있다. 경요도 카테터 삽입술이 현재 남녀 모두의 마우스에서도 수행되었기 때문에11, 이러한 실험은 연구팀의 필요에 따라 성별 또는 다양한 크기의 마우스 또는 쥐에 쉽게 적응할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
요로 상피 ATP 방출에 대한 대부분의 연구는 불멸화 된 세포주 또는 설치류 요로 상피 세포의 1 차 배양을 사용하여 배양 된 세포에서 수행됩니다. 이러한 모델은 상대적으로 높은 처리량(즉, 하나의 배양/계대가 많은 세포 플레이트/접시를 만들 수 있음)이라는 이점이 있지만, 1) 특수 지지체에서 성장하지 않는 한 요로 상피 세포가 분극적으로 성장할 수 없고 2) 배양된 세포를 생리학적 수준의 스?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 국립 당뇨병 및 소화기 및 신장 질환 연구소 (NIDDK)에서 JMB (DK117884)로의 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| amplifier | World Precision Instruments (WPI) | SYS-TBM4M | |
| ATP assay kit | Sigma-Aldrich, Inc. | FLAA-1KT | |
| data acquisition system/ software | DataQ Instruments | DI-1100 | Software included, requires Windows-based computer |
| Hexamethonium bromide | Sigma-Aldrich, Inc. | H0879 | 20 mg/kg dose |
| Isoflurane | Covetrus North America | 29404 | |
| lidocaine | Covetrus North America | 2468 | |
| Luer Lock plugs | Fisher Scientific | NC0455253 | |
| luminometer (GloMax 20/20) | Promega | E5311 | |
| Polyethylene (PE50) tubing | Fisher Scientific | 14-170-12B | |
| Pump 33 DDS syringe pump | Harvard Apparatus | 703333 | |
| pressure transducers | World Precision Instruments (WPI) | BLPR2 | |
| surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.) | Fine Science Tools | multiple numbers | |
| surgical lubricant | Fisher Scientific | 10-000-694 | |
| Sur-Vet I.V. catheter | Covetrus North America | 50603 | 20 G x 1 inch |
| tiltable surgical table (Plas Labs) | Fisher Scientific | 01-288-30A | |
| Tubing connectors | Fisher Scientific | 14-826-19E | allows Luer-Lock connectors to attach to tubing |
| Urethane | Sigma-Aldrich, Inc. | U2500 | 0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose |
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