В городе Виво Просветное измерение высвобождения уротелиального АТФ, вызванного растяжением, у грызунов
Summary
Данный протокол описывает процедуру измерения концентраций АТФ в просвете мочевого пузыря у обезболенного грызуна.
Abstract
АТФ, высвобождаемый из уротелия в ответ на растяжение мочевого пузыря, как полагают, играет значительную сенсорную роль в контроле мочеиспускания. Поэтому точное измерение высвобождения уротелиальной АТФ в физиологических условиях является важным первым шагом в изучении механизмов, которые контролируют пуринергическую сигнализацию в мочевом пузыре. Существующие методы изучения механически вызванного высвобождения уротелиального АТФ используют культивируемые клетки, покрытые гибкими опорами или тканью мочевого пузыря, закрепленной в камерах Ussing; однако каждый из этих методов не полностью эмулирует состояния в неповрежденном мочевом пузыре. Поэтому была разработана экспериментальная установка для непосредственного измерения концентраций АТФ в просвете мочевого пузыря грызунов.
В этой установке мочевые пузыри анестезированных грызунов перфузируются через катетеры как в куполе мочевого пузыря, так и через наружное уретральное отверстие. Давление в мочевом пузыре увеличивается путем закрытия уретрального катетера при перфузии стерильной жидкости в мочевой пузырь через купол. Измерение внутрипузырного давления достигается с помощью датчика давления, прикрепленного к купольному катетеру мочевого пузыря, аналогично установке, используемой для цистометрии. Как только желаемое давление достигнуто, крышка уретрального катетера удаляется, а жидкость собирается для количественной оценки АТФ с помощью анализа люциферин-люциферазы. С помощью этой экспериментальной установки механизмы, контролирующие как механическую, так и химическую стимуляцию высвобождения уротелиального АТФ, могут быть опрошены путем включения различных агонистов или антагонистов в перфусат или путем сравнения результатов между диким типом и генетически модифицированными животными.
Introduction
Считается, что АТФ в моче играет значительную сенсорную роль в контроле мочеиспускания1. Например, считается, что АТФ высвобождается из уротелия в ответ на растяжение, где он может воздействовать на рецепторы афферентных нервов мочевого пузыря, чтобы увеличить их возбудимость, что приводит к ощущениям полноты2. Таким образом, также считается, что атФ мочи может быть важным игроком в развитии патологий мочевого пузыря. В подтверждение этой гипотезы концентрации АТФ в моче значительно повышены у пациентов, страдающих гиперактивным мочевым пузырем (ОАБ)3, синдромом боли в мочевом пузыре / интерстициальным циститом (BPS / IC) 4 или инфекцией мочевыводящих путей (ИМП) 5,6, все состояния характеризуются повышенной срочностью, частотой и, иногда, болью. И наоборот, было показано, что у пациентов, страдающих недостаточной активностью мочевого пузыря (UAB), который характеризуется неспособностью опорожнить мочевой пузырь и иногда может включать снижение способности чувствовать полноту мочевого пузыря, было показано снижение концентрации АТФв моче 7. Экспериментально манипуляции с концентрациями АТФ в моче могут изменить рефлексы мочевого пузыря у крыс; увеличение концентрации АТФ путем блокирования эндогенных АТФаз в просвете мочевого пузыря может увеличить частоту мочеиспускания, в то время как снижение концентрации АТФ путем закапывания экзогенных АТФаз в мочевой пузырь снижает частоту мочеиспускания8. Таким образом, важность АТФ в моче для функции мочевого пузыря очевидна.
Учитывая очевидную важность АТФ в моче для патологии мочевого пузыря, точное измерение высвобождения уротелиального АТФ является важным шагом в понимании механизмов, контролирующих высвобождение. Многие исследования были завершены с использованием различных экспериментальных моделей для измерения высвобождения уротелиального АТФ. Главными среди них являются клеточные культуры, либо первичные культуры, либо клеточные линии. Однако использование культивируемых уротелиальных клеток осложняется тем фактом, что уротелиальные клетки не приобретают свою физиологическую поляризованную морфологию, если они не выращиваются на специальных проницаемых мембранах (таких как технология Transwell [вставки колодца])9. Таким образом, трудно связать какое-либо высвобождение АТФ, измеренное с физиологией. Уротелиальные клетки, выращенные на колодцах, могут поляризоваться и образовывать барьер, похожий на то, что видно in vivo; однако рост полностью дифференцированного уротелия может занять дни или недели. Кроме того, хотя можно хорошо установить вставки в камеру Ussing и приложить давление к апикальной стороне, чтобы вызвать растяжение, трудно применить достаточное давление, чтобы имитировать условия внутри мочевого пузыря во время патологии (т. Е. Давление 30 см H2O или выше). Вся ткань мочевого пузыря также может быть установлена в камере Ussing для экспериментов с растяжкой, но это удаляет мочевой пузырь из организма вместе с трофическими факторами, поддерживающими здоровье уротелиальных клеток и, следовательно, функцию уротелиального барьера. Поэтому наиболее физиологически значимым способом изучения высвобождения АТФ из уротелия в ответ на растяжение или давление является in vivo. Хирургические методы, необходимые для проведения эксперимента, идентичны тем, которые обычно используются в цистометрии животных, и, следовательно, должны быть легко выполнены любым, кто знаком с этой техникой.
В этом протоколе мы опишем методику, используемую для исследования просветной АТФ у самок крыс Sprague Dawley массой примерно 200-250 г, так как трансуретральная катетеризация, описанная ниже, намного легче у самок; однако трансуретральная катетеризация также может быть выполнена у самцов грызунов10. Поскольку трансуретральная катетеризация в настоящее время проводится у мышей обоих полов, а также11, эти эксперименты могут быть легко адаптированы для мышей или крыс любого пола или различных размеров, в зависимости от потребностей исследовательской группы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Большинство исследований высвобождения уротелиального АТФ проводится в культивируемых клетках с использованием либо увековеченных клеточных линий, либо первичных культур уротелиальных клеток грызунов. Хотя эти модели имеют преимущество в том, что они имеют относительно высокую про…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом Национального института диабета и заболеваний пищеварительной системы и почек (NIDDK) JMB (DK117884).
Materials
| amplifier | World Precision Instruments (WPI) | SYS-TBM4M | |
| ATP assay kit | Sigma-Aldrich, Inc. | FLAA-1KT | |
| data acquisition system/ software | DataQ Instruments | DI-1100 | Software included, requires Windows-based computer |
| Hexamethonium bromide | Sigma-Aldrich, Inc. | H0879 | 20 mg/kg dose |
| Isoflurane | Covetrus North America | 29404 | |
| lidocaine | Covetrus North America | 2468 | |
| Luer Lock plugs | Fisher Scientific | NC0455253 | |
| luminometer (GloMax 20/20) | Promega | E5311 | |
| Polyethylene (PE50) tubing | Fisher Scientific | 14-170-12B | |
| Pump 33 DDS syringe pump | Harvard Apparatus | 703333 | |
| pressure transducers | World Precision Instruments (WPI) | BLPR2 | |
| surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.) | Fine Science Tools | multiple numbers | |
| surgical lubricant | Fisher Scientific | 10-000-694 | |
| Sur-Vet I.V. catheter | Covetrus North America | 50603 | 20 G x 1 inch |
| tiltable surgical table (Plas Labs) | Fisher Scientific | 01-288-30A | |
| Tubing connectors | Fisher Scientific | 14-826-19E | allows Luer-Lock connectors to attach to tubing |
| Urethane | Sigma-Aldrich, Inc. | U2500 | 0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose |
Riferimenti
- Burnstock, G. Purinergic signalling in the urinary tract in health and disease. Purinergic Signalling. 10 (1), 103-155 (2014).
- Birder, L. A. Urothelial signaling. Autonomic Neuroscience: Basic & Clinical. 153 (1-2), 33-40 (2010).
- Silva-Ramos, M., et al. Urinary ATP may be a dynamic biomarker of detrusor overactivity in women with overactive bladder syndrome. PLoS One. 8 (5), 64696 (2013).
- Sun, Y., Chai, T. C. Augmented extracellular ATP signaling in bladder urothelial cells from patients with interstitial cystitis. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 290 (1), 27-34 (2006).
- Gill, K., et al. Urinary ATP as an indicator of infection and inflammation of the urinary tract in patients with lower urinary tract symptoms. BMC Urology. 15 (1), 7 (2015).
- Säve, S., Persson, K. Extracellular ATP and P2Y receptor activation induce a proinflammatory host response in the human urinary tract. Infection and Immunity. 78 (8), 3609-3615 (2010).
- Munoz, A., Smith, C. P., Boone, T. B., Somogyi, G. T. Overactive and underactive bladder dysfunction is reflected by alterations in urothelial ATP and NO release. Neurochemistry International. 58 (3), 295-300 (2011).
- Beckel, J. M., et al. Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder. The Journal of Physiology. 593 (8), 1857-1871 (2015).
- Zhang, Y. Y., Ludwikowski, B., Hurst, R., Frey, P. Expansion and long-term culture of differentiated normal rat urothelial cells in vitro. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 37 (7), 419-429 (2001).
- Lee, S., Carrasco, A., Meacham, R. B., Malykhina, A. P. Transurethral instillation procedure in adult male mouse. Journal of Visualized Experiments. (129), e56663 (2017).
- Zychlinsky Scharff, A., Albert, M. L., Ingersoll, M. A. Urinary tract infection in a small animal model: Transurethral catheterization of male and female mice. Journal of Visualized Experiments. (130), e54432 (2017).
- Uvin, P., et al. The use of cystometry in small rodents: a study of bladder chemosensation. Journal of Visualized Experiments. (66), e3869 (2012).
- Leitao, J. M., Esteves da Silva, J. C. Firefly luciferase inhibition. Journal of Photochemistry and Photobiology B. 101 (1), 1-8 (2010).
- Auld, D. S., Thorne, N., Nguyen, D. T., Inglese, J. A specific mechanism for nonspecific activation in reporter-gene assays. ACS Chemical Biology. 3 (8), 463-470 (2008).
- Harvey, E. N. Studies on the oxidation of luciferin without luciferase and the mechanism of bioluminescence. Journal of Biological Chemistry. 78 (2), 369-375 (1928).
- Wang, J., Jackson, D. G., Dahl, G. The food dye FD&C Blue No. 1 is a selective inhibitor of the ATP release channel Panx1. The Journal of General Physiology. 141 (5), 649-656 (2013).
- Avazpour, M., Shiri, S., Delpisheh, A., Abbasi, A. M. Simultaneous determination of brilliant blue FCF and carmoisine in food samples by aqueous two-phase system and spectrophometric detection. Journal of Basic Research in Medical Sciences. 1 (1), 56-65 (2014).
