JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biochemistry

Enkeltmolekyldiffusjon og montering på polymerfylte lipidmembraner

Published: July 19, 2022
doi:
10.3791/64243
, , , , ,
1Department of Chemical Engineering,Indian Institute of Science, 2Holonyak Micro & Nanotechnology Lab,University of Illinois, Urbana-Champaign, 3Center for BioSystems Science and Engineering,Indian Institute of Science

Summary

Her presenteres en protokoll for å utføre og analysere binding, mobilitet og montering av enkeltmolekyler på kunstige overfylte lipidmembraner ved bruk av enkeltmolekyl total intern refleksjonsfluorescens (smTIRF) mikroskopi.

Abstract

Cellulære membraner er svært overfylte miljøer for biomolekylære reaksjoner og signalering. Likevel bruker de fleste in vitro-eksperimenter som undersøker proteininteraksjon med lipider nakne dobbeltlagsmembraner. Slike systemer mangler kompleksiteten ved trengsel av membraninnstøpte proteiner og glykaner og utelukker de tilknyttede volumeffektene som oppstår på cellulære membranoverflater. Også den negativt ladede glassoverflaten som lipid-dobbeltlagene dannes på, forhindrer fri diffusjon av transmembrane biomolekyler. Her presenterer vi en godt karakterisert polymer-lipidmembran som en etterligning for overfylte lipidmembraner. Denne protokollen benytter polyetylenglykol (PEG)-konjugerte lipider som en generalisert tilnærming for å inkorporere crowders i det støttede lipid dobbeltlaget (SLB). Først presenteres en rengjøringsprosedyre for mikroskopiske lysbilder og deksler for å utføre enkeltmolekyleksperimenter. Deretter diskuteres metoder for å karakterisere PEG-SLBene og utføre enkeltmolekyleksperimenter av binding, diffusjon og montering av biomolekyler ved bruk av enkeltmolekylsporing og fotobleking. Til slutt demonstrerer denne protokollen hvordan man overvåker nanopore-samlingen av bakteriell poredannende toksin Cytolysin A (ClyA) på overfylte lipidmembraner med enkeltmolekylær fotoblekingsanalyse. MATLAB-koder med eksempeldatasett er også inkludert for å utføre noen av de vanlige analysene som partikkelsporing, ekstrahering av diffusiv oppførsel og telling av underenheter.

Introduction

Cellemembraner er svært overfylte og komplekse systemer1. Molekylær trenging kan ha en betydelig innvirkning på diffusjonen av membranbundne enheter som protein og lipider 2,3,4. På samme måte påvirkes bimolekylære reaksjoner på lipidmembraner som reseptordimerisering eller oligomerisering av membrankomplekser av trengsel 5,6,7. Naturen, konfigurasjonen og konsentrasjonen av crowders kan styre membranbindingen, diffusiviteten og protein-proteininteraksjonen på flere måter 8,9. Siden det er utfordrende å kontrollere membranbelastning på cellulære membraner og tolke dens innflytelse på innebygde biomolekyler, har forskere forsøkt å etablere alternative in vitro-systemer 10.

En populær tilnærming for kunstige overfylte membraner er doping av dobbeltlagsmembranene med polymer (som polyetylenglykol, PEG)-podede lipider11,12. Under visualisering av protein og lipiddynamikk på støttede lipid dobbeltlag (SLBer), beskytter disse polymerene i tillegg de membraninnebygde komponentene fra det underliggende negativt ladede substratet (for eksempel glass) ved effektivt å løfte dobbeltlaget bort fra den underliggende støtten. Ved å variere størrelsen og konsentrasjonen av polymeren, kan man kontrollere omfanget av molekylær trengsel, samt dens separasjon fra den underliggende faste støtten13,14. Dette er helt klart en fordel i forhold til lipid-dobbeltlag som støttes på faste underlag uten polymerputer15,16, hvor transmembrane biomolekyler kan miste sin aktivitet17,18,19. Enda viktigere, det tillater oss å rekapitulere det overfylte miljøet i cellemembranen in vitro, noe som er kritisk for mange membranprosesser.

Overflatetransplanterte polymerer på membraner gjennomgår også endringer i konfigurasjonen avhengig av deres podningstetthet12. Ved lave konsentrasjoner forblir de i en entropisk kveilet konfigurasjon, kjent som en sopp, over membranoverflaten. Med økende konsentrasjon begynner de å samhandle og har en tendens til å løsne og utvide seg, noe som til slutt gir en tett børstelignende formasjon på membranen21. Siden overgangen fra sopp til børsteregimet er svært heterogen og manifesterer seg i dårlig karakteriserte forhold av polymeren, er det viktig å bruke godt karakteriserte forhold for trengsel på polymertransplanterte membraner. Sammenlignet med en nylig studie20, identifiserer og rapporterer vi overfylte membransammensetninger som opprettholder diffusiv transport og aktivitet av transmembrane biomolekyler.

I denne protokollen diskuterer vi hvordan man genererer PEGylerte lipidmembraner og gir anbefalinger for PEG-tettheter som etterligner trengsel i to forskjellige regimer av polymerkonfigurasjon (nemlig sopp og børste). Protokollen beskriver også enkeltmolekylbinding, partikkelsporing og fotobleking av datainnsamling og analyse for molekyler innebygd i disse overfylte membranene. Først beskriver vi de grundige rengjøringstrinnene, montering av bildekammeret og generering av PEG-SLB-er. For det andre gir vi detaljer for enkeltmolekylbinding, partikkelsporing og fotoblekingseksperimenter. For det tredje diskuterer vi i) å trekke ut de relative bindingsaffinitetene, ii) karakterisere molekylær diffusjon og iii) telle underenheter i en proteinsamling fra filmer av enkeltmolekyler på membranen.

Mens vi karakteriserte dette systemet med enkeltmolekylavbildning, er protokollen nyttig for alle membranbiofysikere som er interessert i å forstå effekten av trengsel på biomolekylære reaksjoner på lipidmembraner. Samlet sett presenterer vi en robust rørledning for å lage overfylte og støttede lipid-dobbeltlag, sammen med forskjellige enkeltmolekylanalyser utført på dem og tilhørende analyserutiner.

Protocol

1. Rengjøring av lysbildet og dekselet for enkeltmolekyleksperimenter Før montering av bildekammeret, rengjør og klargjør både dekslene og lysbildene. Bor flere par hull på glassglassene ved hjelp av en boremaskin med diamantbelagte borekroner (0,5-1 mm i diameter). Hvis akrylplater brukes, bruk en laserskjærer for å lage presise hull (0,5 mm), som vist i figur 1.MERK: Hvert par hull vil fungere som et innløp og utløp for strømningsutveksling for et …

Representative Results

Overvåking av bindingen av ClyA-protein på PEGylerte membranerEtter trinn 4.5 estimeres bindingskinetikken ved å plotte antall partikler som binder seg til membranoverflaten over tid (Video 1). Når ClyA-proteinet binder seg til en membran med 5 mol% PEG2000 lipider, øker partikkeltettheten og når metning (figur 5). En eksponentiell henfallstilpasning til de bundne partiklene (cyansirkler) gir tidskonstanten (τb) for membranbindingen (sp…

Discussion

Her demonstrerer vi enkeltmolekyleksperimenter på støttede lipid-dobbeltlag (SLB) som manifesterer et overfylt miljø for membraninnstøpte biomolekyler. Det overfylte miljøet genererer en ekskludert volumeffekt, noe som fører til forbedring av biomolekylære reaksjoner 1,2,39,40. For PEG-lipidsystemet, hvor polymeren primært opptar volumet utenfor dobbeltlaget, er denne effekten spesielt …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne anerkjenner prof. Benjamin Schuler for å dele uttrykket plasmid for ClyA-protein. Dette arbeidet ble støttet av Human Frontier Science Program (RGP0047-2020).

Materials

2.5 ml Syringes HMD Healthcare Dispo Van, 2.5 ml Tuberculin Plastic syringe
Acetone Finar Chemicals 10020LL025
Acrylic Sheet 2 mm thick
Acrylic Sheet BigiMall 2 mm, Clear
Bath Sonicator Branson CPX-1800
Calcium Chloride
Chloroform Sigma 528730  HPLC grade
Cholesterol Avanti 700100
Coplin Jar Duran Wheaton Kimble S6016 8 Slide Jar with Glass Cover
Coverslips VWR 631-1574 24 mm X 50 mm
Cy3-DNA Strand IDT GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT
GGTGTGGTTGG-Cy3
Cyanine Dye (Cy3) Cytiva Life Sciences PA23001
DiI Invitrogen D3911 Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))
DNA Connector Strand 1 Sigma Aldrich GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT
GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC
T
DNA Connector Strand 2 Sigma Aldrich CGGACGCAATAGCAGCTCACAG
TCGGTCACAT
DNA Tocopherol Strand Biomers Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA
DOPE-PEG2000 Avanti 880130 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)
Double Sided Tape 3M LF93010LE
Drill Bits (Diamond Coated) 0.5 – 1 mm
Drilling Machine Dremel 220 Workstation
EMCCD Andor DU-897U-CS0-#BV
Fluorescence Beads Invitrogen F10720
Glass Slides Blue Star Micro Slides, PIC-1
Glass Vials Sigma 854190
Hydrogen Peroxide Lobachemie 00182 30% Solution, AR Grade
Labolene Thermo-Fischer Scientific  Detergent
Laser 532 nm Coherent Sapphire
Laser Cutter Universal Laser Systems ILS12.75
Lissamine Rhodamine DOPE Avanti 810150 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)
Methanol Finar Chemicals 30932LL025
Microscope Olympus IX81
Phosphate Buffer Saline (PBS) 1X
Plasma Cleaner Harrick Plasma Inc PDC-002
POPC Avanti 850457 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine
Programmable Syringe Pump New Era Pump Systems NE1010 High Pressure Syringe Pump
PTFE Caps Sigma 27141
PTFE Tubing Cole-Parmer WW-06417-21 Masterflex, 0.022" ID x 0.042" OD
Sulphuric Acid SD Fine Chemicals 98%, AR Grade
TIRF Objective Olympus UPLAPO100XOHR
Vacuum Desiccator Tarsons
Vortex Mixer Tarsons
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Löwe, M., Kalacheva, M., Boersma, A. J., Kedrov, A. The more the merrier: Effects of macromolecular crowding on the structure and dynamics of biological membranes. The FEBS Journal. 287 (23), 5039-5067 (2020).
  2. Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
  3. Horton, M. R., Höfling, F., Rädler, J. O., Franosch, T. Development of anomalous diffusion among crowding proteins. Soft Matter. 6 (12), 2648-2656 (2010).
  4. Jeon, J. H., Javanainen, M., Martinez-Seara, H., Metzler, R., Vattulainen, I. Protein crowding in lipid bilayers gives rise to non-Gaussian anomalous lateral diffusion of phospholipids and proteins. Physical Review X. 6 (2), 021006 (2016).
  5. Zhang, Y., et al. The influence of molecular reach and diffusivity on the efficacy of membrane-confined reactions. Biophysical Journal. 117 (7), 1189-1201 (2019).
  6. Loverdo, C., Bénichou, O., Moreau, M., Voituriez, R. Enhanced reaction kinetics in biological cells. Nature Physics. 4 (2), 134-137 (2008).
  7. Monine, M. I., Haugh, J. M. Reactions on cell membranes: Comparison of continuum theory and Brownian dynamics simulations. Journal of Chemical Physics. 123 (7), 074908 (2005).
  8. Berry, H. Anomalous diffusion due to hindering by mobile obstacles undergoing Brownian motion or Orstein-Ulhenbeck processes. Physical Review E. 89 (2), 22708 (2014).
  9. Saxton, M. J. Anomalous diffusion due to obstacles: A Monte Carlo study. Biophysical Journal. 66 (2), 394-401 (1994).
  10. Andersson, J., Fuller, M. A., Wood, K., Holt, S. A., Köper, I. A tethered bilayer lipid membrane that mimics microbial membranes. Physical Chemistry Chemical Physics. 20 (18), 12958-12969 (2018).
  11. Kaufmann, S., Papastavrou, G., Kumar, K., Textor, M., Reimhult, E. A detailed investigation of the formation kinetics and layer structure of poly(ethylene glycol) tether supported lipid bilayers. Soft Matter. 5 (14), 2804-2814 (2009).
  12. Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
  13. Labouta, H. I., et al. Surface-grafted polyethylene glycol conformation impacts the transport of PEG-functionalized liposomes through a tumour extracellular matrix model. RSC Advances. 8 (14), 7697-7708 (2018).
  14. Lee, H., Larson, R. G. Adsorption of plasma proteins onto PEGylated lipid bilayers: The effect of PEG size and grafting density. Biomacromolecules. 17 (5), 1757-1765 (2016).
  15. Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. Formation of solid-supported lipid bilayers: An integrated view. Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).
  16. Andersson, J., et al. Solid-supported lipid bilayers – A versatile tool for the structural and functional characterization of membrane proteins. Methods. 180, 56-68 (2020).
  17. Duncan, A. L., et al. Protein crowding and lipid complexity influence the nanoscale dynamic organization of ion channels in cell membranes. Scientific Reports. 7 (1), 1-15 (2017).
  18. Garenne, D., Libchaber, A., Noireaux, V. Membrane molecular crowding enhances MreB polymerization to shape synthetic cells from spheres to rods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 1902-1909 (2020).
  19. Pollock, N. L., Lee, S. C., Patel, J. H., Gulamhussein, A. A., Rothnie, A. J. Structure and function of membrane proteins encapsulated in a polymer-bound lipid bilayer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1860 (4), 809-817 (2018).
  20. Coker, H. L. E., et al. Controlling anomalous diffusion in lipid membranes. Biophysical Journal. 116 (6), 1085-1094 (2019).
  21. Rex, S., Zuckermann, M. J., Lafleur, M., Silvius, J. R. Experimental and Monte Carlo simulation studies of the thermodynamics of polyethyleneglycol chains grafted to lipid bilayers. Biophysical Journal. 75 (6), 2900-2914 (1998).
  22. Hallett, F. R., Watton, J., Krygsman, P. Vesicle sizing number distributions by dynamic light scattering. Biophysical Journal. 59 (2), 357-362 (1991).
  23. Jin, A. J., Huster, D., Gawrisch, K., Nossal, R. Light scattering characterization of extruded lipid vesicles. European Biophysics Journal. 28 (3), 187-199 (1999).
  24. Axelrod, D. Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).
  25. Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. 50 (1), 1-13 (2009).
  26. Fiolka, R., Belyaev, Y., Ewers, H., Stemmer, A. Even illumination in total internal reflection fluorescence microscopy using laser light. Microscopy Research and Technique. 71 (1), 45-50 (2008).
  27. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  28. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
  29. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  30. Jarmoskaite, I., Alsadhan, I., Vaidyanathan, P. P., Herschlag, D. How to measure and evaluate binding affinities. eLife. 9, 57264 (2020).
  31. Sathyanarayana, P., et al. Cholesterol promotes Cytolysin A activity by stabilizing the intermediates during pore formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7323-7330 (2018).
  32. Mueller, M., Grauschopf, U., Maier, T., Glockshuber, R., Ban, N. The structure of a cytolytic alpha-helical toxin pore reveals its assembly mechanism. Nature. 459 (7247), 726-730 (2009).
  33. Hubicka, K., Janczura, J. Time-dependent classification of protein diffusion types: A statistical detection of mean-squared-displacement exponent transitions. Physical Review E. 101 (2), 1-13 (2020).
  34. Kepten, E., Weron, A., Sikora, G., Burnecki, K., Garini, Y. Guidelines for the fitting of anomalous diffusion mean square displacement graphs from single particle tracking experiments. PLoS ONE. 10 (2), 0117722 (2015).
  35. Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nature Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
  36. McGuire, H., Aurousseau, M. R. P., Bowie, D., Blunck, R. Automating single subunit counting of membrane proteins in mammalian cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35912-35921 (2012).
  37. Hines, K. E. Inferring subunit stoichiometry from single molecule photobleaching. The Journal of General Physiology. 141 (6), 737-746 (2013).
  38. Zhang, H., Guo, P. Single molecule photobleaching (SMPB) technology for counting of RNA, DNA, protein and other molecules in nanoparticles and biological complexes by TIRF instrumentation. Methods. 67 (2), 169-176 (2014).
  39. Phillip, Y., Schreiber, G. Formation of protein complexes in crowded environments-From in vitro to in vivo. FEBS Letters. 587 (8), 1046-1052 (2013).
  40. Mittal, S., Chowhan, R. K., Singh, L. R. Macromolecular crowding: Macromolecules friend or foe. Biochimica et Biophysica Acta – General Subjects. 1850 (9), 1822-1831 (2015).
  41. Mashaghi, S., van Oijen, A. M. A versatile approach to the generation of fluid supported lipid bilayers and its applications. Biotechnology and Bioengineering. 111 (10), 2076-2081 (2014).
  42. Wong, W. C., et al. Characterization of single-protein dynamics in polymer-cushioned lipid bilayers derived from cell plasma membranes. The Journal of Physical Chemistry B. 123 (30), 6492-6504 (2019).
  43. Shashkova, S. S., Leake, M. C. Single-molecule fluorescence microscopy review: Shedding new light on old problems. Bioscience Reports. 37 (4), 20170031 (2017).
  44. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced fluorescence microscopy techniques-FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047 (2012).
  45. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  46. Carter, B. C., Vershinin, M., Gross, S. P. A comparison of step-detection methods: How well can you do. Biophysical Journal. 94 (1), 306-319 (2008).
  47. Otsuka, S., Ellenberg, J. Mechanisms of nuclear pore complex assembly – Two different ways of building one molecular machine. FEBS Letters. 592 (4), 475 (2018).
  48. Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Pressé, S. A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).
  49. Bryan, J. S., Sgouralis, I., Pressé, S. Enumerating high numbers of fluorophores from photobleaching experiments: A Bayesian nonparametrics approach. bioRxiv. , (2020).
  50. Bryan, J. S., Sgouralis, I., Pressé, S. Diffraction-limited molecular cluster quantification with Bayesian nonparametrics. Nature Computational Science. 2 (2), 102-111 (2022).
  51. Kim, Y., et al. Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines. Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).

Tags

Single-molecule ImagingPolymer-crowded Lipid MembranesSupported Lipid BilayersMembrane Biomolecular ReactionsDiffusionAssemblyPOPCDOPE-PEG(2000)Small Unilamellar VesiclesSonicationMicrofluidic Imaging Chambers
check_url/64243?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Maurya, S., Rai, V. H., Upasani, A., Umrao, S., Parwana, D., Roy, R. Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes. J. Vis. Exp. (185), e64243, doi:10.3791/64243 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image