Isolamento e Caracterização da Microbiota Natural do Nematoide Modelo Caenorhabditis elegans

Summary

Caenorhabditis elegans é uma das principais espécies modelo em biologia, mas quase todas as pesquisas são realizadas na ausência de seus micróbios naturalmente associados. Os métodos descritos aqui ajudarão a melhorar nossa compreensão da diversidade de micróbios associados como base para futuras pesquisas funcionais de C. elegans.

Abstract

O nematoide Caenorhabditis elegans interage com uma grande diversidade de microrganismos na natureza. Em geral, C. elegans é comumente encontrado em matéria vegetal podre, especialmente frutas podres como maçãs ou em pilhas de compostagem. Também está associada a certos hospedeiros invertebrados, como lesmas e piolhos. Esses habitats são ricos em micróbios, que servem de alimento para C. elegans e que também podem colonizar persistentemente o intestino dos nematoides. Até o momento, a diversidade exata e a consistência da microbiota nativa de C. elegans em habitats e localizações geográficas não são totalmente compreendidas. Aqui, descrevemos uma abordagem adequada para isolar C. elegans da natureza e caracterizar a microbiota de vermes. Os nematoides podem ser facilmente isolados do material de compostagem, maçãs podres, lesmas ou atraídos pela colocação de maçãs em pilhas de compostagem. O horário nobre para encontrar C. elegans no Hemisfério Norte é de setembro a novembro. Os vermes podem ser lavados do material de substrato coletado por imersão do substrato em solução tampão, seguida pela coleta de nematoides e sua transferência para o meio de crescimento de nematoides ou tampão de PCR para análise subsequente. Ilustramos ainda como as amostras podem ser usadas para isolar e purificar os microrganismos associados a vermes e para processar vermes para análise de RNA ribossômico 16S da composição da comunidade de microbiota. No geral, os métodos descritos podem estimular novas pesquisas sobre a caracterização da microbiota de C. elegans em habitats e localizações geográficas, ajudando assim a obter uma compreensão abrangente da diversidade e estabilidade da microbiota do nematoide como base para futuras pesquisas funcionais.

Introduction

Na natureza, C. elegans é comumente encontrada em matéria vegetal podre, especialmente frutas podres como maçãs ou em pilhas de composto¹. Também está associada a certos hospedeiros invertebrados, como lesmas e piolhos ^2,3. Esses habitats são ricos em micróbios, que não só servem de alimento para o verme, mas também podem formar associações estáveis com ele. As informações sobre a diversidade de microrganismos naturalmente associados só foram publicadas em 2016 ^4,5,6. Desde então, esses e apenas alguns estudos mais recentes revelaram que C. elegans está associada a uma variedade de bactérias e fungos, mais comumente incluindo bactérias do gênero Pseudomonas, Enterobacter, Ochrobactrum, Erwinia, Comamonas, Gluconobacter e várias outras 6,7,8. Várias bactérias associadas podem colonizar de forma estável o intestino do verme, embora nem todas ^6,9,10,11,12. É provável que eles sejam de importância fundamental para a nossa compreensão da biologia de C. elegans porque podem fornecer nutrição, proteger contra patógenos e possivelmente outros estressores e afetar características centrais da história de vida, como taxa reprodutiva, desenvolvimento ou respostas comportamentais.

Como exemplo, isolados naturalmente associados dos gêneros Pseudomonas, Ochrobactrum, e também Enterobacter ou Gluconobacter podem proteger o verme da infecção por patógenos e matar de maneiras distintas 5,6,11,13,14. Um isolado específico do gênero Comamonas influencia a resposta dietética, o desenvolvimento, a expectativa de vida e a fertilidade dos nematoides^15,16,17. As bactérias de Providencia produzem o neuromodulador tiramina e, assim, modulam a atividade do sistema nervoso do hospedeiro e as respostas comportamentais resultantes¹⁸. Um conjunto de diferentes bactérias naturalmente associadas demonstrou afetar a taxa de crescimento populacional, a fertilidade e as respostas comportamentais ^5,6,9,11,19.

Até o momento, a diversidade exata e a consistência da microbiota nativa de C. elegans em habitats e localizações geográficas não são totalmente compreendidas, e outras associações entre o verme e os micróbios de seu ambiente ainda precisam ser descobertas. Vários estudos anteriores utilizaram cepas bacterianas isoladas de algum ambiente de solo, habitats naturais de C. elegans ou de experimentos de mesocosmo (ou seja, ambientes baseados em laboratório que recriam habitats naturais) com cepas de laboratório de C. elegans ^4,5,20. Embora esses estudos tenham obtido novos insights sobre a influência de micróbios em características específicas de nematoides (por exemplo, metabolismo de nematoides²¹), a relevância dessas interações para a biologia de C. elegans na natureza não é clara. Portanto, este manuscrito descreve os métodos para isolar diretamente C. elegans da natureza e para isolar e, posteriormente, caracterizar os micróbios naturalmente associados de ambos os vermes únicos e grupos de vermes. Os métodos descritos são uma versão atualizada e aprimorada dos procedimentos utilizados anteriormente para o isolamento e caracterização de C. elegans natural e sua microbiota nativa 2,6,7. Considerando que C. elegans é amplamente encontrada em matéria vegetal em decomposição em todo o mundo (especialmente em frutos em decomposição, regiões temperadas e no outono)1,22,22,23,24,25^, esse protocolo pode ser aplicado por qualquer laboratório sempre que houver interesse em relacionar C. elegans características de micróbios naturalmente associados e, portanto, um contexto mais naturalmente relevante. Este último é fundamental para uma compreensão completa da biologia do nematoide, porque é sabido a partir de uma diversidade de outros sistemas hospedeiros que a microbiota associada pode afetar diversas características da história de vida²⁶, um aspecto que atualmente é amplamente negligenciado na infinidade de estudos de C. elegans em quase todas as disciplinas de ciências da vida.

Protocol

1. Preparação de buffers e meios Preparar o tampão S adicionando 5,85 g de NaCl, 1,123 g de K 2 HPO 4, 5,926 g de KH 2 PO4 e 1 L de H 2O deionizado a um balão e a uma autoclave durante 20 minutos a 121 °C. Prepare um meio viscoso adicionando tampão S contendo 1,2% (p/v) de hidroximetilcelulose (a substância causadora da viscosidade do meio), 5 mg/mL de colesterol, 1 mM de MgSO4, 1 mM de CaCl2 e 0,1% (v…

Representative Results

O nematoide C. elegans é frequentemente encontrado em frutas em decomposição, como maçãs, e também amostras de compostagem. No norte da Alemanha, C. elegans, bem como espécies congenéricas (particularmente C. remanei, mas também C. briggsae) são encontradas principalmente de setembro a2 de novembro. Os nematoides são mais comumente encontrados em matéria vegetal em decomposição, especialmente frutas podres, como maçãs ou peras, e também composto…

Discussion

O nematoide Caenorhabditis elegans é um dos organismos modelo mais intensamente estudados em pesquisas biológicas. Foi introduzido por Sydney Brenner na década de 1960, originalmente para entender o desenvolvimento e a função do sistema nervoso²⁹. Desde então, C. elegans tornou-se um modelo poderoso para estudar processos fundamentais em todas as disciplinas biológicas, incluindo biologia comportamental, neurobiologia, envelhecimento, biologia evolutiva, biologia celular, …

Materials

COMSOL

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multiphysics simulation software