X線励起発光によるインプラント関連感染症の高空間分解能化学イメージング 組織イメージング
Summary
ここでは、X線励起発光化学イメージング(XELCI)を用いて、移植された医療機器周辺の化学情報を高解像度で光学的に検出するためのプロトコルを紹介します。この新しいイメージング技術は、インプラント関連感染症の生化学の研究を可能にする私たちの研究室で開発されています。
Abstract
埋め込み型医療機器に関連する微生物感染は、骨折固定不全の主要な懸念事項です。このような感染症の早期診断により、2回目の手術に追加費用をかけずに抗生物質による根絶を成功させることができます。ここでは、XELCIを、高いX線分解能、インプラント特異性、および埋め込み型医療機器の表面近くの化学物質濃度を非侵襲的に画像化する化学物質に対する化学物質感受性を備えた技術として説明します。デバイスは、化学的に報告する表面でコーティングされています。この化学的に応答する表面は、埋め込み型医療機器にコーティングされた2つの層で構成されています。pH感受性層(ブロモチモールブルーまたはブロモクレゾールグリーン組み込みヒドロゲル)を、モニタリング用の赤色発光シンチレータ(Gd2O2S:Eu)層上にコーティングする。集束X線ビームがインプラント上のスポットに照射され、シンチレータによって生成された赤色光(620nmおよび700nmのピークを持つ)は、pHに応じてスペクトル比を変化させる検出層を透過します。画像は、インプラントを横切ってX線ビームをスキャンし、組織を通過する光のスペクトル比をポイントごとに測定することによって生成されます。このイメージング技術を使用して、修正された埋め込み型プレートセンサーを使用して、以前は大腿骨の骨表面でのインプラント関連感染を監視していました。現在、脛骨髄内桿体感染によるpH変化について研究しています。パイロット前のウサギの研究では、2種類の髄内ロッド設計が使用されており、XELCI技術を使用して、骨表面だけでなく骨内部でも発生する化学変化を監視できることを学びました。したがって、これにより、インプラント関連感染症の生化学を研究するための非侵襲的、高空間分解能、低バックグラウンドの局所pHイメージングが可能になります。
Introduction
米国では、年間約200万個の骨折固定装置が挿入されており、そのうちの5%〜10%がインプラント関連感染症につながっています1。これらの感染症は、バイオフィルムの不均一性と抗生物質耐性の性質のために、後の段階で抗生物質で治療するのが困難です2,3。早期に診断された場合、感染症は抗生物質と外科的創面切除剤で治療され、治療された骨折部位のハードウェアを交換するための2回目の手術のための余分な医療費を防ぐことができます。プレーンX線撮影およびその他の高度なX線撮影技術は、整形外科インプラント関連感染症、非結合、および関連する合併症の診断に適用されます。これらの技術は、整形外科インプラントで周囲の骨や組織の構造情報を取得するために頻繁に使用されますが、特定の環境では生化学的情報を提供することはできません。そこで我々は、インプラント部位の生化学情報を非侵襲的に高解像度でイメージングする新しいX線励起発光化学イメージング(XELCI)技術を開発しました。整形外科インプラント関連感染症の診断は、一般に、異なる手段の1つまたは組み合わせによって行われる。臨床観察(痛み、腫れ、発赤、創傷分泌物など)は、感染の最初の兆候を示唆しています。その後、骨治癒進行の失敗を確認し、病原性生物を特定するために、放射線学的および実験室実験が行われる4,5。感染したインプラントと関連する感染をよりよく視覚化するために、コンピューター断層撮影(CT)、磁気共鳴画像法(MRI)、および単一光子放出コンピューター断層撮影(SPECT)や陽電子放出断層撮影(PET)などの放射性ヌクレオチド法などの核医学技術が使用されています6,7。CTおよびMRIは、それぞれ骨壊死および軟部組織異常の判定に有利であるが、金属インプラント8に近い距離で干渉を引き起こす。SPECTやPETなどのさまざまなX線方法論と放射性同位元素標識分析物をin vivoイメージング造影剤として組み合わせることで、インプラント関連骨髄炎の診断に広く使用されています2。現在のアプリケーションは、CTスキャンからのデータとSPECTまたはPETのいずれかからのラベリングデータの両方を組み合わせて、解剖学的情報を生成します9。これらの画像診断の1つ以上は感染診断を支援するために使用されますが、余分な医療費や外科的費用を避けるために抗生物質による治療を開始するために感染に関連するpH変動を早期に検出することはできません。
この研究で使用したイメージングシステムをインプラント関連感染症のモニタリングに利用する主な利点は、スペクトル参照を使用してバイオフィルム微小環境に関する生化学的情報を明らかにすることができることです。主な焦点は感染部位のpHのイメージングとマッピングですが、この方法は、インプラント関連感染症に特異的な他のバイオマーカーを監視するように変更できます。したがって、XELCIは感染症の病態生理学を理解することを可能にする。高空間分解能イメージングにより、感染の拡大に伴う不均一性をマッピングできます。バイオフィルム形成が起こる表面のpHは、生化学的変化を理解する上で非常に重要です。また、細菌10,11による抗生物質関連のストレス応答により、他の微小環境の変化が発生する可能性があります。表面特異的で空間分解能の高いイメージングにより、バイオフィルム微小環境に対する抗生物質の影響をモニターすることができます。この技術は、標的薬物送達実験のためのバイオフィルム環境を研究するためにも使用できます。標的とした低pHの薬物放出やpHの上昇を研究して、高pHでの作業を受けやすくすることができます。
このイメージング技術の3つの特定の特性は、X線分解能、インプラント表面特異性、および化学物質感受性です(図1A)。これらの特性は、整形外科インプラント関連感染症を画像化するために現在利用可能な画像化技術と比較することができる(図1B)。X線を照射すると、インプラント表面にコーティングされた蛍光体粒子は、数センチメートルの組織を透過できる赤色および近赤外(NIR)光を生成します(多少の減衰はありますが)12,13。表1は、バイオフィルム中または組織を通してpHを測定するために使用されてきた他の方法と比較した、開発されたイメージングシステムの特徴のいくつかを示しています。
XELCIは、図2に示すように、X線励起と組み合わせて、埋め込み型医療機器の近くで光学的に空間分解能の高い化学情報を取得するための新しいイメージング技術です。ここではX線励起性蛍光体粒子の選択的励起や光学的検出が利用される。インプラントは、シンチレータ粒子の層の上にポリマー層を組み込んだpH感受性色素の2つの層でコーティングされている。集束された一連のX線ビームがインプラントに照射されると、シンチレータ層は可視光(620nmおよび700nm)を生成する。この生成された光は、周囲の環境のpHに応じて発光スペクトルを調節するpH感受性層を通過します。低pHは一般に感染とバイオフィルム形成に関連しています。感染が進行するにつれて、pHは生理的pH(pH 7.2)から酸性(pH 7未満)に変化し、センサー内のpH染料は色を変え、したがって吸光度を変化させます。ルミネッセンススペクトルの変化を、pH 7およびpH 4におけるブロモクレゾールグリーンpH色素について図2Eに示す。組織と骨を透過した光が収集され、スペクトル比がpHを決定します。pH画像を生成するために、集束されたX線ビームはシンチレータフィルム内の一度に一点ずつ照射し、サンプルを横切ってビームを点ごとにスキャンします。以前、この技術は、整形外科インプラント14、15の表面のpH変動を画像化するために適用され、骨および組織を通る髄内管内のpH変動を監視するためにそれを試験してきた。
下の図3は、イメージングシステムの概略図を示しています。イメージングシステムの基本コンポーネントは、ポリキャピラリー光学系を備えたX線励起源、2つの光電子増倍管に接続するワンピースのアクリルライトガイド、x、y、z電動ステージ(30 cm x 15 cm x 6 cmトラベル)、およびデータ収集用に接続されたコンピューターです。X線源、x、y、zステージ、および収集光学系(エルボ、ライトガイド、光電子増倍管(PMT))はX線防止エンクロージャ内にあり、X線コントローラ、PMT用電源、データ収集(DAQ)ボードに接続された関数発生器、およびコンピュータは外部に保管されています。エンクロージャとドアの前面の間に配置されたプッシュボタン、ノーマルオープンスイッチは、インターロックとして機能します。ドアが完全に閉じていない(インターロックスイッチが開いている)場合、X線源はオンにならず、動作中に開くと自動的にX線源がオフになります。モーターは連続スキャンを実行でき、任意の離散的な場所に移動できます。y軸のスキャン速度は通常1〜5 mm / sですが、x軸のステップサイズは通常150〜2000μmから選択できます。パラメータは、必要な空間分解能に応じて選択できます。露光時間でさえ、連続スキャンを通して一貫した速度によって確認されます。
集束されたX線ビームがX線発光粒子に照射されると、生成された光は周囲のpHに応じて光を変調することによってpH感受性膜を通過します。透過光は組織と相互作用(部分的に散乱および吸収)しますが、散乱および吸収による光減衰は、組織の厚さが増すにつれて増加します。コレクション光学系には、最初に反射アルミニウムエルボ(90°曲げと研磨された反射内面)が取り付けられたワンピースの二股アクリルライトガイドが含まれています。これは、光がライトガイドに到達するとすぐに光がコリメートされるようにするためです。これらの追加により、集光効率が大幅に向上しました。詳細については、図4にエルボとライトガイドの機械 図 を示します。90°エルボはアルミニウムから機械加工され、内面は鏡面仕上げに研磨され、ライトガイドはアクリルで機械加工されました。また、肘の始めに広範囲のロングパス青色光フィルター(350〜450nmの光を遮断)を取り付けて、赤色光のみが通過するようにしました。ワンピースのアクリルライトガイドの端は、2つの異なるPMTにつながる2つのストリームに分岐します。PMTは、PMTを~5°Cに冷却するために熱電冷却器と接触する小さな遮光金属ボックスに封入されています。 PMTの1つの開始時に、700nmの光のみを測定するために、狭い範囲のロングパスフィルター(570〜640nmの光を遮断し、640〜740nmの光を通過させる)が取り付けられています。したがって、620nmと700nmの光は別々に計算することができる。PMTはフォトンカウンティングモードで設定され、検出されたフォトンごとにトランジスタ-トランジスタロジック(TTL)パルスを生成します。DAQシステムは、USB通信を使用してパルス(飽和点2,000万パルス/秒)をカウントします。データを処理した後、2つの別々の強度マップが生成され、信号波長強度(620 nm)と参照波長強度(700 nm)の比を考慮して最終的な画像が作成されます。この比率は、集光光学系の位置、X線照射強度、組織の厚さに強く依存する総集光効率の違いを説明しています。さらに、pH指示色素のない空間的に分離された参照領域は、波長依存的な組織浸透によるスペクトル歪みを説明します。イメージングシステムの制御にはグラフィックベースのプログラミング言語が使用されており、動作の基本的なフローチャートを以下に示します。コンピュータ、X線コントローラ、およびDAQユニットを除くイメージングセットアップは、放射線被曝を最小限に抑えるために安全なX線エンクロージャに囲まれています。
Protocol
Representative Results
Discussion
骨髄炎や二次手術による合併症を回避するために、整形外科インプラント関連感染症を早期に検出および研究できるようにするために、新しい機能的イメージング技術としてXELCIを導入しました。これは、組織を介したpHモニタリングのために現在利用可能な技術に匹敵します。
イメージングのためにサンプルを配置する際には、ポリキャピラリーフォーカシング光学系?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、クレムソン大学、COMSET、クレムソンSC BioCRAFTに感謝したい。XELCIのセットアップは、当初はNSFキャリアCHE 12255535からの資金で開発され、後にNIH NIAMS R01 AR070305-01によって開発されました。
Materials
| 90 degree elbow | Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA | ||
| Bromo Cresol Green | Sigma-Aldrich | 45ZW10 | |
| Bromo Thymol Blue | Sigma | 76-59-5 | |
| ElectraCOOL Advanced thermoelectric cool plate | Pollock industries, White River, VT, USA | TCP 50 | |
| Ethanol | Beantown Chemical, 9 Sagamore Park Road Hudson, NH 03051 |
64-17-5 | |
| Gadolinium Oxysulfide Europium doped (Gd2O2S:Eu) particles-~8.0 µm | Phosphor Technologies Inc., Stevenage, England | UKL63/N-R1 | |
| LabVIEW | National Instruments, Austin, TX | ||
| Motorized Linear Vertical Stage Model (for Z axis) | Motion Control, Smithtown, NY, USA | AT10-60 | |
| National instruments c-DAQ 9171 | National Instruments, Austin, TX | NI cDAQ™-9171 | |
| One piece acrylic light guide | Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA | ||
| pH 4 buffer | VWR BDH Chemicals | BDH5024 | |
| pH 8 buffer | VWR BDH Chemicals | BDH5060 | |
| Phosphate Buffer Solution | MP Biomedicals, Irvine, CA. USA | 2810305 | |
| Photo multiplier tubes Model P25PC-16 | SensTech, Surrey, UK | Model P25PC-16 | |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ATCC 25923 | |
| Tryptic Soy Agar | Teknova, Hollister, CA, USA | T0520 | |
| Tryptic Soy Broth | EMD Millipore, Burlington, MA, USA | 1005255000 | |
| X-ray source-iMOXS | Institute for Scientific Instruments GmbH, Berlin, Germany | ||
| X,Y motorized stage-30 cm x 15 cm x 6 cm travel | Thorlabs Inc., Newton, NJ, USA | LTS300 and LTS150 |
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