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Biochimica

Visualizzazione della dinamica conformazionale dei recettori di membrana utilizzando FRET a singola molecola

Published: August 17, 2022
doi:
10.3791/64254
, ,
1Department of Molecular Biosciences,Northwestern University

Summary

Questo studio presenta una procedura dettagliata per eseguire esperimenti di trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza a singola molecola (smFRET) sui recettori accoppiati a proteine G (GPCR) utilizzando la marcatura sito-specifica tramite incorporazione di amminoacidi innaturali (UAA). Il protocollo fornisce una guida passo-passo per la preparazione dei campioni smFRET, gli esperimenti e l’analisi dei dati.

Abstract

La capacità delle cellule di rispondere ai segnali esterni è essenziale per lo sviluppo, la crescita e la sopravvivenza cellulare. Per rispondere a un segnale proveniente dall’ambiente, una cellula deve essere in grado di riconoscerlo ed elaborarlo. Questo compito si basa principalmente sulla funzione dei recettori di membrana, il cui ruolo è quello di convertire i segnali nel linguaggio biochimico della cellula. I recettori accoppiati alle proteine G (GPCR) costituiscono la più grande famiglia di proteine recettoriali di membrana nell’uomo. Tra i GPCR, i recettori metabotropici del glutammato (mGluR) sono una sottoclasse unica che funziona come dimeri obbligati e possiede un ampio dominio extracellulare che contiene il sito di legame del ligando. I recenti progressi negli studi strutturali dei mGluR hanno migliorato la comprensione del loro processo di attivazione. Tuttavia, la propagazione di cambiamenti conformazionali su larga scala attraverso mGluR durante l’attivazione e la modulazione è poco conosciuta. Il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza a singola molecola (smFRET) è una tecnica potente per visualizzare e quantificare la dinamica strutturale delle biomolecole a livello di singola proteina. Per visualizzare il processo dinamico di attivazione di mGluR2, sono stati sviluppati sensori conformazionali fluorescenti basati sull’incorporazione di amminoacidi innaturali (UAA) che hanno permesso la marcatura proteica sito-specifica senza perturbazioni della struttura nativa dei recettori. Il protocollo qui descritto spiega come eseguire questi esperimenti, incluso il nuovo approccio di etichettatura UAA, la preparazione del campione e l’acquisizione e l’analisi dei dati smFRET. Queste strategie sono generalizzabili e possono essere estese per studiare le dinamiche conformazionali di una varietà di proteine di membrana.

Introduction

Il trasferimento di informazioni attraverso la membrana plasmatica dipende fortemente dalla funzione dei recettori di membrana1. Il legame del ligando a un recettore porta a un cambiamento conformazionale e all’attivazione del recettore. Questo processo è spesso di natura allosterica2. Con oltre 800 membri, i recettori accoppiati a proteine G (GPCR) sono la più grande famiglia di recettori di membrana nell’uomo3. A causa del loro ruolo in quasi tutti i processi cellulari, i GPCR sono diventati obiettivi importanti per lo sviluppo terapeutico. Nel modello canonico di segnalazione GPCR, l’attivazione agonista provoca cambiamenti conformazionali del recettore che successivamente attivano il complesso della proteina G eterotrimerica attraverso lo scambio di GDP per GTP nella tasca di legame nucleotidico di Gα. Le subunità G α-GTP e Gβγ attivate controllano quindi l’attività delle proteine effettrici a valle e propagano la cascata di segnalazione 4,5. Questo processo di segnalazione dipende essenzialmente dalla capacità dei ligandi di cambiare la forma tridimensionale del recettore. Una comprensione meccanicistica di come i ligandi raggiungono questo obiettivo è fondamentale per lo sviluppo di nuove terapie e la progettazione di recettori e sensori sintetici.

I recettori metabotropici del glutammato (mGluR) sono membri della famiglia GPCR di classe C e sono importanti per gli effetti neuromodulatori lenti del glutammato e per la sintonizzazione dell’eccitabilità neuronale 6,7. Tra tutti i GPCR, i GPCR di classe C sono strutturalmente unici in quanto funzionano come dimeri obbligati. mGluR contiene tre domini strutturali: il dominio Venere acchiappamosche (VFT), il dominio ricco di cisteina (CRD) e il dominio transmembrana (TMD)8. I cambiamenti conformazionali durante il processo di attivazione sono complessi e coinvolgono l’accoppiamento conformazionale locale e globale che si propaga su una distanza di 12 nm, così come la cooperatività del dimero. Le conformazioni intermedie, l’ordinamento temporale degli stati e il tasso di transizione tra gli stati sono sconosciuti. Seguendo in tempo reale la conformazione dei singoli recettori è possibile individuare gli stati intermedi transitori e la sequenza dei cambiamenti conformazionali durante l’attivazione. Questo può essere ottenuto applicando il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza a singola molecola 9,10 (smFRET), come è stato recentemente applicato per visualizzare la propagazione dei cambiamenti conformazionali durante l’attivazione di mGluR2 11. Un passo fondamentale negli esperimenti FRET è la generazione di sensori FRET mediante inserimento sito-specifico dei fluorofori donatori e accettori nella proteina di interesse. Una strategia di incorporazione di aminoacidi innaturali (UAA) è stata adottata12,13,14,15 per superare i limiti delle tipiche tecnologie di etichettatura fluorescente sito-specifiche che richiedono la creazione di mutanti senza cisteina o l’inserimento di un grande tag geneticamente codificato. Ciò ha permesso di osservare il riarrangiamento conformazionale dell’essenziale linker allosterico compatto, che si univa ai domini di legame e segnalazione del ligando di mGluR2. In questo protocollo, viene presentata una guida passo-passo per eseguire esperimenti smFRET su mGluR2, incluso l’approccio per l’etichettatura sito-specifica di mGluR2 con UAA per attaccare fluorofori utilizzando la reazione di ciclizzazione dell’azide catalizzata dal rame. Inoltre, questo protocollo descrive la metodologia per la cattura diretta delle proteine di membrana e l’analisi dei dati. Il protocollo qui delineato è applicabile anche allo studio della dinamica conformazionale di altre proteine di membrana.

Protocol

Il flusso di lavoro complessivo del protocollo è descritto nella Figura 1. 1. Preparazione della camera di campionamento Pulizia vetrini e coprivetriniNOTA: Questi passaggi mirano a pulire le superfici dei vetrini e dei vetrini e prepararli per l’aminosilanizzazione. Un requisito critico per condurre esperimenti di fluorescenza a singola molecola su molecole legate alla superficie è una superficie passivata. La tecnica di passivazione più affi…

Representative Results

Espressione ed etichettatura fluorescente di sensori FRET basati su UAAQuivengono discussi i risultati esemplari dell’inserimento e dell’etichettatura fluorescente di una UAA (AZP) all’interno del CRD di mGluR2 (548UAA). Come accennato in precedenza, per inserire AZP in mGluR2, è necessaria la co-espressione del macchinario traslazionale ingegnerizzato, che include una tRNA sintetasi modificata e tRNA complementare (pIRE4-Azi), e mGluR2 contenente un codone ambrato in posizio…

Discussion

I GPCR sono proteine che operano sulla membrana cellulare per avviare la trasduzione del segnale. Molti GPCR sono costituiti da più domini, con la segnalazione dipendente dall’interazione cooperativa tra i domini. Per modulare le proprietà di questi recettori di membrana, è essenziale comprendere il comportamento dinamico dei molteplici domini. Il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza a singola molecola (smFRET) è una tecnica di fluorescenza che consente la misurazione della conformazione e della dina…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo i membri del laboratorio Reza Vafabakhsh per le discussioni. Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione R01GM140272 del National Institutes of Health (a R.V.), dal Searle Leadership Fund for the Life Sciences della Northwestern University e dal Chicago Biomedical Consortium con il supporto dei Searle Funds del Chicago Community Trust (a R.V.). B.W.L. è stato sostenuto dal National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Training Grant T32GM-008061.

Materials

(+)-Sodium L-Ascorbate Sigma Aldrich Cat # 11140-250G
4-azido-L-phenylalanine Chem-Impex International Cat # 06162
548UAA Liauw et al. 2021 Transfected construct
Acetic Acid Fisher Chemical 64-19-7
Acetone Fisher Chemical 67-64-1
Adobe Illustrator (2022) https://www.adobe.com/ RRID:SCR_010279 Software, algorithm
Aminoguanidine (hydrochloride) Cayman Chemical 81530
Aminosilane Aldrich 919-30-2
Bath Sonicator 2.8 L Fisher Scientific Ultrasonic Bath 2.8 L
Biotin-PEG Laysan Bio Inc Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg
BTTES Click Chemistry Tools 1237-500
Copper (II) sulfate Sigma Aldrich Cat # 451657-10G
Cover slip VWR 16004-306 Sample chamber
Cy3 Alkyne Click Chemistry Tools TA117-5
Cy5 Alkyne Click Chemistry Tools TA116-5
DDM Anatrace Part# D310 1 GM Detergent
DDM-CHS (10:1) Anatrace Part# D310-CH210 1 ML Detergent with cholecterol
Defined Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific SH30070.03
Di01-R405/488/561/635 Semrock Notch filter
DMEM Corning 10-013-CV
EMCCD Andor DU-897U Camera
ET542lp Chroma Long pass emission filter
FF640-FDi01 Semrock Emission dichroic filter
FLAG-tag antibody Genscript A01429
Fluorescent bead Invitrogen T7279 TetraSpeck microspheres Spherical bead
Glass slides Fisherfinest 12-544-4 sample chamber
Glutamate Sigma Aldrich Cat # 6106-04-3
HEK 293T Sigma Aldrich Cat # 12022001 Cell line
HEPES FisherBioReagents 7365-45-9
Image splitter OptoSplit II
KOH Fluka 1310-58-3
Laser Oxxius 4-line laser combiner
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific L3000015 Transfection Reagent
Methanol Fisher Chemical 67-56-1
Microscope Olympus Olympus IX83
Milli-Q water Barnstead Water Deionizer
m-PEG Laysan Bio Inc Item# MPEG-SIL-5000-1g
NF03-405/488/532/635 Semrock Dichroic mirror
OptiMEM Thermo Fisher Scientific 51985091 Reduced Serum Medium
OptiMEM/Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific
OriginPro (2020b) https://www.originlab.com/ RRID:SCR_014212 Data analysis and graphing software
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
pIRE4-Azi Addgene Plasmid # 105829 Transfected construct
Poly-L-lysine hydrobromide Sigma Aldrich Cat # P2636
Protocatechuic acid (PCA) HWI group 99-50-3
smCamera (Version 1.0) http://ha.med.jhmi.edu/resources/ Camera software
Sodium bicarbonate FisherBioReagents 144-55-8
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma 1310-73-2
Syringe filter Whatman UNIFLO Cat#9914-2502 Liquid filtration
Trolox Sigma 53188-07
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Riferimenti

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Keywords: Single-molecule FRETMembrane ReceptorsConformational DynamicsProtein LabelingMGluR2HEK 293T CellsPEGylationAmino SalinizationDremelAcetonePotassium HydroxideMethanolPoly-L/D-lysineTransfectionAlkyne Cyanine Dyes
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Banerjee, C., Liauw, B. W., Vafabakhsh, R. Visualizing the Conformational Dynamics of Membrane Receptors Using Single-Molecule FRET. J. Vis. Exp. (186), e64254, doi:10.3791/64254 (2022).
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