Visualisering av konformasjonsdynamikken til membranreseptorer ved bruk av enkeltmolekyl FRET
Summary
Denne studien presenterer en detaljert prosedyre for å utføre enkeltmolekylfluorescensresonansenergioverføringseksperimenter (smFRET) på G-proteinkoblede reseptorer (GPCR) ved bruk av stedsspesifikk merking via unaturlig aminosyre (UAA) inkorporering. Protokollen gir en trinnvis veiledning for smFRET-prøvepreparering, eksperimenter og dataanalyse.
Abstract
Cellens evne til å reagere på eksterne signaler er avgjørende for cellulær utvikling, vekst og overlevelse. For å svare på et signal fra miljøet, må en celle kunne gjenkjenne og behandle det. Denne oppgaven er hovedsakelig avhengig av funksjonen til membranreseptorer, hvis rolle er å konvertere signaler til cellens biokjemiske språk. G-proteinkoblede reseptorer (GPCR) utgjør den største familien av membranreseptorproteiner hos mennesker. Blant GPCR er metabotrope glutamatreseptorer (mGluRs) en unik underklasse som fungerer som obligatoriske dimerer og har et stort ekstracellulært domene som inneholder ligandbindingsstedet. Nylige fremskritt innen strukturelle studier av mGluRs har forbedret forståelsen av aktiveringsprosessen. Imidlertid er forplantningen av store konformasjonsendringer gjennom mGluRs under aktivering og modulering dårlig forstått. Enkeltmolekylfluorescensresonansenergioverføring (smFRET) er en kraftig teknikk for å visualisere og kvantifisere den strukturelle dynamikken til biomolekyler på enkeltproteinnivå. For å visualisere den dynamiske prosessen med mGluR2-aktivering ble fluorescerende konformasjonssensorer basert på unaturlig aminosyre (UAA) inkorporering utviklet som tillot stedsspesifikk proteinmerking uten forstyrrelse av den opprinnelige strukturen til reseptorer. Protokollen beskrevet her forklarer hvordan du utfører disse eksperimentene, inkludert den nye UAA-merkingsmetoden, prøvepreparering og smFRET-datainnsamling og analyse. Disse strategiene er generaliserbare og kan utvides for å undersøke konformasjonsdynamikken til en rekke membranproteiner.
Introduction
Overføringen av informasjon over plasmamembranen er sterkt avhengig av funksjonen til membranreseptorer1. Ligandbinding til en reseptor fører til konformasjonsendring og reseptoraktivering. Denne prosessen er ofte allosterisk i naturen2. Med over 800 medlemmer er G-proteinkoblede reseptorer (GPCR) den største familien av membranreseptorer hos mennesker3. På grunn av deres rolle i nesten alle cellulære prosesser, har GPCR blitt viktige mål for terapeutisk utvikling. I den kanoniske modellen for GPCR-signalering resulterer agonistaktivering i konformasjonsendringer av reseptoren som deretter aktiverer det heterotrimere G-proteinkomplekset via utveksling av BNP for GTP ved nukleotidbindingslommen til Gα. De aktiverteG-α-GTP– og Gβγ-underenhetene styrer deretter aktiviteten til nedstrøms effektorproteiner og forplanter signalkaskaden 4,5. Denne signalprosessen avhenger i hovedsak av ligandens evne til å endre den tredimensjonale formen på reseptoren. En mekanistisk forståelse av hvordan ligander oppnår dette er avgjørende for å utvikle nye terapier og designe syntetiske reseptorer og sensorer.
Metabotrope glutamatreseptorer (mGluRs) er medlemmer av klasse C GPCR-familien og er viktige for de langsomme nevromodulerende effektene av glutamat og tuning neuronal excitability 6,7. Blant alle GPCR-er er GPCR-er i klasse C strukturelt unike ved at de fungerer som obligatoriske dimere. mGluRs inneholder tre strukturelle domener: Venus flytrap (VFT) domene, cysteinrikt domene (CRD) og transmembrandomene (TMD)8. Konformasjonsendringene under aktiveringsprosessen er komplekse og involverer lokal og global konformasjonskobling som forplanter seg over en avstand på 12 nm, samt dimerkooperativitet. De mellomliggende konformasjonene, tidsmessig rekkefølge av stater og overgangshastighet mellom stater er ukjente. Ved å følge konformasjonen av individuelle reseptorer i sanntid, er det mulig å identifisere de forbigående mellomtilstandene og sekvensen av konformasjonsendringer under aktivering. Dette kan oppnås ved å bruke enkeltmolekylfluorescensresonansenergioverføring 9,10 (smFRET), som nylig ble brukt for å visualisere forplantningen av konformasjonsendringer under aktiveringen av mGluR2 11. Et viktig trinn i FRET-eksperimenter er generering av FRET-sensorer ved stedsspesifikk innsetting av donor- og akseptorfluoroforer i proteinet av interesse. En unaturlig aminosyre (UAA) inkorporeringsstrategi ble vedtatt12,13,14,15 for å overvinne begrensningene i typiske stedsspesifikke fluorescerende merkingsteknologier som krever opprettelse av cysteinfrie mutanter eller innsetting av en stor genetisk kodet tag. Dette gjorde det mulig å observere konformasjonsomleggingen av den essensielle kompakte allosteriske linkeren, som sluttet seg til ligandbindings- og signaldomenene til mGluR2. I denne protokollen presenteres en trinnvis veiledning for å utføre smFRET-eksperimenter på mGluR2, inkludert tilnærmingen for stedsspesifikk merking av mGluR2 med UAA for å feste fluoroforer ved hjelp av den kobberkatalyserte azidsykliseringsreaksjonen. Videre beskriver denne protokollen metodikken for direkte fangst av membranproteiner og dataanalyse. Protokollen som er skissert her, gjelder også for å studere konformasjonsdynamikken til andre membranproteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
GPCR er proteiner som opererer på cellemembranen for å initiere signaltransduksjon. Mange GPCR-er består av flere domener, med signalering avhengig av samarbeidsinteraksjonen mellom domenene. For å modulere egenskapene til disse membranreseptorene, er det viktig å forstå den dynamiske oppførselen til de mange domenene. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET) er en fluorescensteknikk som muliggjør måling av proteinkonformasjon og dynamikk i sanntid11,32<s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker medlemmer av Reza Vafabakhsh-laboratoriet for diskusjoner. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health-tilskuddet R01GM140272 (til R.V.), av The Searle Leadership Fund for the Life Sciences ved Northwestern University, og av Chicago Biomedical Consortium med støtte fra Searle Funds ved Chicago Community Trust (til R.V.). BWL ble støttet av National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Training Grant T32GM-008061.
Materials
| (+)-Sodium L-Ascorbate | Sigma Aldrich | Cat # 11140-250G | |
| 4-azido-L-phenylalanine | Chem-Impex International | Cat # 06162 | |
| 548UAA | Liauw et al. 2021 | Transfected construct | |
| Acetic Acid | Fisher Chemical | 64-19-7 | |
| Acetone | Fisher Chemical | 67-64-1 | |
| Adobe Illustrator (2022) | https://www.adobe.com/ | RRID:SCR_010279 | Software, algorithm |
| Aminoguanidine (hydrochloride) | Cayman Chemical | 81530 | |
| Aminosilane | Aldrich | 919-30-2 | |
| Bath Sonicator 2.8 L | Fisher Scientific | Ultrasonic Bath 2.8 L | |
| Biotin-PEG | Laysan Bio Inc | Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg | |
| BTTES | Click Chemistry Tools | 1237-500 | |
| Copper (II) sulfate | Sigma Aldrich | Cat # 451657-10G | |
| Cover slip | VWR | 16004-306 | Sample chamber |
| Cy3 Alkyne | Click Chemistry Tools | TA117-5 | |
| Cy5 Alkyne | Click Chemistry Tools | TA116-5 | |
| DDM | Anatrace | Part# D310 1 GM | Detergent |
| DDM-CHS (10:1) | Anatrace | Part# D310-CH210 1 ML | Detergent with cholecterol |
| Defined Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH30070.03 | |
| Di01-R405/488/561/635 | Semrock | Notch filter | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| EMCCD | Andor | DU-897U | Camera |
| ET542lp | Chroma | Long pass emission filter | |
| FF640-FDi01 | Semrock | Emission dichroic filter | |
| FLAG-tag antibody | Genscript | A01429 | |
| Fluorescent bead | Invitrogen T7279 | TetraSpeck microspheres | Spherical bead |
| Glass slides | Fisherfinest | 12-544-4 | sample chamber |
| Glutamate | Sigma Aldrich | Cat # 6106-04-3 | |
| HEK 293T | Sigma Aldrich | Cat # 12022001 | Cell line |
| HEPES | FisherBioReagents | 7365-45-9 | |
| Image splitter | OptoSplit II | ||
| KOH | Fluka | 1310-58-3 | |
| Laser | Oxxius | 4-line laser combiner | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | Transfection Reagent |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Milli-Q water | Barnstead | Water Deionizer | |
| m-PEG | Laysan Bio Inc | Item# MPEG-SIL-5000-1g | |
| NF03-405/488/532/635 | Semrock | Dichroic mirror | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 51985091 | Reduced Serum Medium |
| OptiMEM/Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | ||
| OriginPro (2020b) | https://www.originlab.com/ | RRID:SCR_014212 | Data analysis and graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pIRE4-Azi | Addgene | Plasmid # 105829 | Transfected construct |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | Cat # P2636 | |
| Protocatechuic acid (PCA) | HWI group | 99-50-3 | |
| smCamera (Version 1.0) | http://ha.med.jhmi.edu/resources/ | Camera software | |
| Sodium bicarbonate | FisherBioReagents | 144-55-8 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | 1310-73-2 | |
| Syringe filter | Whatman UNIFLO | Cat#9914-2502 | Liquid filtration |
| Trolox | Sigma | 53188-07 |
Riferimenti
- Smock, R. G., Gierasch, L. M. Sending signals dynamically. Science. 324 (5924), 198-203 (2009).
- Changeux, J. P., Christopoulos, A. Allosteric modulation as a unifying mechanism for receptor function and regulation. Cell. 166 (5), 1084-1102 (2016).
- Tang, X. -. l., Wang, Y., Li, D. -. l., Luo, J., Liu, M. -. Y. Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets. Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 363-371 (2012).
- Chung, K. Y., et al. Conformational changes in the G protein Gs induced by the β2 adrenergic receptor. Nature. 477 (7366), 611-615 (2011).
- Vafabakhsh, R., Levitz, J., Isacoff, E. Y. Conformational dynamics of a class C G-protein-coupled receptor. Nature. 524 (7566), 497-501 (2015).
- Niswender, C. M., Conn, P. J. Metabotropic glutamate receptors: Physiology, pharmacology, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 50, 295-322 (2010).
- Pin, J. P., Bettler, B. Organization and functions of mGlu and GABA(B) receptor complexes. Nature. 540 (7631), 60-68 (2016).
- Kniazeff, J., et al. Closed state of both binding domains of homodimeric mGlu receptors is required for full activity. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (8), 706-713 (2004).
- Ha, T. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 25 (1), 78-86 (2001).
- Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
- Liauw, B. W. -. H., Afsari, H. S., Vafabakhsh, R. Conformational rearrangement during activation of a metabotropic glutamate receptor. Nature Chemical Biology. 17 (3), 291-297 (2021).
- Noren, C. J., Anthonycahill, S. J., Griffith, M. C., Schultz, P. G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins. Science. 244 (4901), 182-188 (1989).
- Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
- Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S. X., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. G Protein Coupled Receptors: Structure. 520, 281-305 (2013).
- Serfling, R., Coin, I., Pecoraro, V. Chapter Four – Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods in Enzymology. 580, 89-107 (2016).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Cordes, T., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent. Journal of the American Chemical Society. 131 (14), 5018-5019 (2009).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Lee, S., et al. How do short chain nonionic detergents destabilize G-protein-coupled receptors. Journal of the American Chemical Society. 138 (47), 15425-15433 (2016).
- Cao, A. -. M., et al. Allosteric modulators enhance agonist efficacy by increasing the residence time of a GPCR in the active state. Nature Communications. 12 (1), 1-13 (2021).
- Mancebo, A., Mehra, D., Banerjee, C., Kim, D. -. H., Puchner, E. M. Efficient cross-correlation filtering of one-and two-color single molecule localization microscopy data. Frontiers in Bioinformatics. 1, 739769 (2021).
- Mehra, D., Adhikari, S., Banerjee, C., Puchner, E. M. Characterizing locus specific chromatin structure and dynamics with correlative conventional and super-resolution imaging in living cells. Nucleic Acids Research. , (2022).
- Chen, H., Puhl, H. L., Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical Journal. 91 (5), 39-41 (2006).
- Gopich, I. V., Szabo, A. FRET efficiency distributions of multistate single molecules. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (46), 15221-15226 (2010).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-A multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
- Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. Learning rates and states from biophysical time series: A Bayesian approach to model selection and single-molecule FRET data. Biophysical Journal. 97 (12), 3196-3205 (2009).
- Zhang, J., et al. Specific structural elements of the T-box riboswitch drive the two-step binding of the tRNA ligand. Elife. 7, 39518 (2018).
- Goodman, N. R. Statistical analysis based on a certain multivariate complex Gaussian distribution (an introduction). The Annals of Mathematical Statistics. 34 (1), 152-177 (1963).
- Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. Journal of the Royal Society Interface. 5, 131-138 (2008).
- Schamber, M. R., Vafabakhsh, R. Mechanism of sensitivity modulation in the calcium-sensing receptor via electrostatic tuning. Nature Communications. 13 (1), 2194 (2022).
- Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
- Huang, S. K., et al. Delineating the conformational landscape of the adenosine A(2A) receptor during G protein coupling. Cell. 184 (7), 1884-1894 (2021).
- Wingler, L. M., et al. Angiotensin analogs with divergent bias stabilize distinct receptor conformations. Cell. 176 (3), 468-478 (2019).
- Gordon, C. G., et al. Reactivity of biarylazacyclooctynones in copper-free click chemistry. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9199-9208 (2012).
- Kim, E., Koo, H. Biomedical applications of copper-free click chemistry: In vitro, in vivo, and ex vivo. Chemical Science. 10 (34), 7835-7851 (2019).
- Pickens, C. J., Johnson, S. N., Pressnall, M. M., Leon, M. A., Berkland, C. J. Practical considerations, challenges, and limitations of bioconjugation via azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 29 (3), 686-701 (2018).
- Geng, Y., et al. Structural mechanism of ligand activation in human calcium-sensing receptor. Elife. 5, 13662 (2016).
