Visualisering av membranreceptorernas konformationsdynamik med hjälp av enmolekylär FRET
Summary
Denna studie presenterar en detaljerad procedur för att utföra enmolekylära fluorescensresonansenergiöverföringsexperiment (smFRET) på G-proteinkopplade receptorer (GPCR) med hjälp av platsspecifik märkning via onaturlig aminosyra (UAA) införlivande. Protokollet innehåller en steg-för-steg-guide för smFRET-provberedning, experiment och dataanalys.
Abstract
Cellernas förmåga att reagera på externa signaler är avgörande för cellulär utveckling, tillväxt och överlevnad. För att svara på en signal från miljön måste en cell kunna känna igen och bearbeta den. Denna uppgift är huvudsakligen beroende av membranreceptorernas funktion, vars roll är att omvandla signaler till cellens biokemiska språk. G-proteinkopplade receptorer (GPCR) utgör den största familjen av membranreceptorproteiner hos människor. Bland GPCR är metabotropa glutamatreceptorer (mGluRs) en unik underklass som fungerar som obligatoriska dimerer och har en stor extracellulär domän som innehåller ligandbindningsstället. De senaste framstegen inom strukturella studier av mGluRs har förbättrat förståelsen för deras aktiveringsprocess. Emellertid är förökningen av storskaliga konformationsförändringar genom mGluRs under aktivering och modulering dåligt förstådd. Enmolekylär fluorescensresonansenergiöverföring (smFRET) är en kraftfull teknik för att visualisera och kvantifiera den strukturella dynamiken hos biomolekyler på enproteinnivå. För att visualisera den dynamiska processen för mGluR2-aktivering utvecklades fluorescerande konformationssensorer baserade på onaturlig aminosyra (UAA) -införlivande som möjliggjorde platsspecifik proteinmärkning utan störning av receptorernas ursprungliga struktur. Protokollet som beskrivs här förklarar hur man utför dessa experiment, inklusive den nya UAA-märkningsmetoden, provberedning och smFRET-datainsamling och analys. Dessa strategier är generaliserbara och kan utvidgas för att undersöka konformationsdynamiken hos en mängd olika membranproteiner.
Introduction
Överföringen av information över plasmamembranet är starkt beroende av membranreceptorernas funktion1. Livandbindning till en receptor leder till en konformationsförändring och receptoraktivering. Denna process är ofta allosterisk i naturen2. Med över 800 medlemmar är G-proteinkopplade receptorer (GPCR) den största familjen av membranreceptorer hos människor3. På grund av sin roll i nästan alla cellulära processer har GPCR blivit viktiga mål för terapeutisk utveckling. I den kanoniska modellen för GPCR-signalering resulterar agonistaktivering i konformationsförändringar av receptorn som därefter aktiverar det heterotrimera G-proteinkomplexet via utbyte av BNP mot GTP vid nukleotidbindningsfickan på Gα. De aktiverade underenheterna Gα-GTP ochG βγ styr sedan aktiviteten hos nedströms effektorproteiner och sprider signalkaskaden 4,5. Denna signalprocess beror väsentligen på ligandernas förmåga att ändra receptorns tredimensionella form. En mekanistisk förståelse för hur ligander uppnår detta är avgörande för att utveckla nya terapier och designa syntetiska receptorer och sensorer.
Metabotropa glutamatreceptorer (mGluRs) är medlemmar i klass C GPCR-familjen och är viktiga för de långsamma neuromodulerande effekterna av glutamat och tuning neuronal excitabilitet 6,7. Bland alla GPCR är klass C GPCR strukturellt unika genom att de fungerar som obligatoriska dimerer. mGluRs innehåller tre strukturella domäner: Venus flytrap (VFT) domän, cysteinrik domän (CRD) och transmembrandomän (TMD)8. Konformationsförändringarna under aktiveringsprocessen är komplexa och involverar lokal och global konformationskoppling som sprider sig över ett avstånd på 12 nm, liksom dimer kooperativitet. De mellanliggande konformationerna, den tidsmässiga ordningen av tillstånd och övergångshastigheten mellan tillstånd är okända. Genom att följa konformationen av enskilda receptorer i realtid är det möjligt att identifiera de övergående mellanliggande tillstånden och sekvensen av konformationsförändringar under aktivering. Detta kan uppnås genom att tillämpa enmolekylär fluorescensresonansenergiöverföring 9,10 (smFRET), som nyligen tillämpades för att visualisera förökningen av konformationsförändringar under aktiveringen av mGluR2 11. Ett viktigt steg i FRET-experiment är genereringen av FRET-sensorer genom platsspecifik införande av givar- och acceptorfluoroforerna i proteinet av intresse. En onaturlig aminosyra (UAA) inkorporeringsstrategi antogs12,13,14,15 för att övervinna begränsningarna hos typiska platsspecifika fluorescerande märkningstekniker som kräver skapande av cysteinlösa mutanter eller införande av en stor genetiskt kodad tagg. Detta gjorde det möjligt att observera konformationsomläggningen av den väsentliga kompakta allosteriska länkaren, som förenade ligandbindnings- och signaldomänerna för mGluR2. I detta protokoll presenteras en steg-för-steg-guide för att utföra smFRET-experiment på mGluR2, inklusive tillvägagångssättet för platsspecifik märkning av mGluR2 med UAA för att fästa fluoroforer med hjälp av den kopparkatalyserade azidcykliseringsreaktionen. Dessutom beskriver detta protokoll metoden för direkt infångning av membranproteiner och dataanalys. Protokollet som beskrivs här är också tillämpligt för att studera konformationsdynamiken hos andra membranproteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
GPCR är proteiner som opererar på cellmembranet för att initiera signaltransduktion. Många GPCR består av flera domäner, där signalering är beroende av den kooperativa interaktionen mellan domänerna. För att modulera egenskaperna hos dessa membranreceptorer är det viktigt att förstå det dynamiska beteendet hos de flera domänerna. Enmolekylär fluorescensresonansenergiöverföring (smFRET) är en fluorescensteknik som möjliggör mätning av proteinkonformation och dynamik i realtid11,32</s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar medlemmarna i Reza Vafabakhsh-labbet för diskussioner. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health-bidraget R01GM140272 (till R.V.), av The Searle Leadership Fund for the Life Sciences vid Northwestern University och av Chicago Biomedical Consortium med stöd från Searle Funds vid The Chicago Community Trust (till R.V.). B.W.L. stöddes av National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Training Grant T32GM-008061.
Materials
| (+)-Sodium L-Ascorbate | Sigma Aldrich | Cat # 11140-250G | |
| 4-azido-L-phenylalanine | Chem-Impex International | Cat # 06162 | |
| 548UAA | Liauw et al. 2021 | Transfected construct | |
| Acetic Acid | Fisher Chemical | 64-19-7 | |
| Acetone | Fisher Chemical | 67-64-1 | |
| Adobe Illustrator (2022) | https://www.adobe.com/ | RRID:SCR_010279 | Software, algorithm |
| Aminoguanidine (hydrochloride) | Cayman Chemical | 81530 | |
| Aminosilane | Aldrich | 919-30-2 | |
| Bath Sonicator 2.8 L | Fisher Scientific | Ultrasonic Bath 2.8 L | |
| Biotin-PEG | Laysan Bio Inc | Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg | |
| BTTES | Click Chemistry Tools | 1237-500 | |
| Copper (II) sulfate | Sigma Aldrich | Cat # 451657-10G | |
| Cover slip | VWR | 16004-306 | Sample chamber |
| Cy3 Alkyne | Click Chemistry Tools | TA117-5 | |
| Cy5 Alkyne | Click Chemistry Tools | TA116-5 | |
| DDM | Anatrace | Part# D310 1 GM | Detergent |
| DDM-CHS (10:1) | Anatrace | Part# D310-CH210 1 ML | Detergent with cholecterol |
| Defined Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH30070.03 | |
| Di01-R405/488/561/635 | Semrock | Notch filter | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| EMCCD | Andor | DU-897U | Camera |
| ET542lp | Chroma | Long pass emission filter | |
| FF640-FDi01 | Semrock | Emission dichroic filter | |
| FLAG-tag antibody | Genscript | A01429 | |
| Fluorescent bead | Invitrogen T7279 | TetraSpeck microspheres | Spherical bead |
| Glass slides | Fisherfinest | 12-544-4 | sample chamber |
| Glutamate | Sigma Aldrich | Cat # 6106-04-3 | |
| HEK 293T | Sigma Aldrich | Cat # 12022001 | Cell line |
| HEPES | FisherBioReagents | 7365-45-9 | |
| Image splitter | OptoSplit II | ||
| KOH | Fluka | 1310-58-3 | |
| Laser | Oxxius | 4-line laser combiner | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | Transfection Reagent |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Milli-Q water | Barnstead | Water Deionizer | |
| m-PEG | Laysan Bio Inc | Item# MPEG-SIL-5000-1g | |
| NF03-405/488/532/635 | Semrock | Dichroic mirror | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 51985091 | Reduced Serum Medium |
| OptiMEM/Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | ||
| OriginPro (2020b) | https://www.originlab.com/ | RRID:SCR_014212 | Data analysis and graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pIRE4-Azi | Addgene | Plasmid # 105829 | Transfected construct |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | Cat # P2636 | |
| Protocatechuic acid (PCA) | HWI group | 99-50-3 | |
| smCamera (Version 1.0) | http://ha.med.jhmi.edu/resources/ | Camera software | |
| Sodium bicarbonate | FisherBioReagents | 144-55-8 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | 1310-73-2 | |
| Syringe filter | Whatman UNIFLO | Cat#9914-2502 | Liquid filtration |
| Trolox | Sigma | 53188-07 |
Riferimenti
- Smock, R. G., Gierasch, L. M. Sending signals dynamically. Science. 324 (5924), 198-203 (2009).
- Changeux, J. P., Christopoulos, A. Allosteric modulation as a unifying mechanism for receptor function and regulation. Cell. 166 (5), 1084-1102 (2016).
- Tang, X. -. l., Wang, Y., Li, D. -. l., Luo, J., Liu, M. -. Y. Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets. Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 363-371 (2012).
- Chung, K. Y., et al. Conformational changes in the G protein Gs induced by the β2 adrenergic receptor. Nature. 477 (7366), 611-615 (2011).
- Vafabakhsh, R., Levitz, J., Isacoff, E. Y. Conformational dynamics of a class C G-protein-coupled receptor. Nature. 524 (7566), 497-501 (2015).
- Niswender, C. M., Conn, P. J. Metabotropic glutamate receptors: Physiology, pharmacology, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 50, 295-322 (2010).
- Pin, J. P., Bettler, B. Organization and functions of mGlu and GABA(B) receptor complexes. Nature. 540 (7631), 60-68 (2016).
- Kniazeff, J., et al. Closed state of both binding domains of homodimeric mGlu receptors is required for full activity. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (8), 706-713 (2004).
- Ha, T. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 25 (1), 78-86 (2001).
- Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
- Liauw, B. W. -. H., Afsari, H. S., Vafabakhsh, R. Conformational rearrangement during activation of a metabotropic glutamate receptor. Nature Chemical Biology. 17 (3), 291-297 (2021).
- Noren, C. J., Anthonycahill, S. J., Griffith, M. C., Schultz, P. G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins. Science. 244 (4901), 182-188 (1989).
- Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
- Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S. X., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. G Protein Coupled Receptors: Structure. 520, 281-305 (2013).
- Serfling, R., Coin, I., Pecoraro, V. Chapter Four – Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods in Enzymology. 580, 89-107 (2016).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Cordes, T., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent. Journal of the American Chemical Society. 131 (14), 5018-5019 (2009).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Lee, S., et al. How do short chain nonionic detergents destabilize G-protein-coupled receptors. Journal of the American Chemical Society. 138 (47), 15425-15433 (2016).
- Cao, A. -. M., et al. Allosteric modulators enhance agonist efficacy by increasing the residence time of a GPCR in the active state. Nature Communications. 12 (1), 1-13 (2021).
- Mancebo, A., Mehra, D., Banerjee, C., Kim, D. -. H., Puchner, E. M. Efficient cross-correlation filtering of one-and two-color single molecule localization microscopy data. Frontiers in Bioinformatics. 1, 739769 (2021).
- Mehra, D., Adhikari, S., Banerjee, C., Puchner, E. M. Characterizing locus specific chromatin structure and dynamics with correlative conventional and super-resolution imaging in living cells. Nucleic Acids Research. , (2022).
- Chen, H., Puhl, H. L., Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical Journal. 91 (5), 39-41 (2006).
- Gopich, I. V., Szabo, A. FRET efficiency distributions of multistate single molecules. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (46), 15221-15226 (2010).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-A multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
- Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. Learning rates and states from biophysical time series: A Bayesian approach to model selection and single-molecule FRET data. Biophysical Journal. 97 (12), 3196-3205 (2009).
- Zhang, J., et al. Specific structural elements of the T-box riboswitch drive the two-step binding of the tRNA ligand. Elife. 7, 39518 (2018).
- Goodman, N. R. Statistical analysis based on a certain multivariate complex Gaussian distribution (an introduction). The Annals of Mathematical Statistics. 34 (1), 152-177 (1963).
- Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. Journal of the Royal Society Interface. 5, 131-138 (2008).
- Schamber, M. R., Vafabakhsh, R. Mechanism of sensitivity modulation in the calcium-sensing receptor via electrostatic tuning. Nature Communications. 13 (1), 2194 (2022).
- Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
- Huang, S. K., et al. Delineating the conformational landscape of the adenosine A(2A) receptor during G protein coupling. Cell. 184 (7), 1884-1894 (2021).
- Wingler, L. M., et al. Angiotensin analogs with divergent bias stabilize distinct receptor conformations. Cell. 176 (3), 468-478 (2019).
- Gordon, C. G., et al. Reactivity of biarylazacyclooctynones in copper-free click chemistry. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9199-9208 (2012).
- Kim, E., Koo, H. Biomedical applications of copper-free click chemistry: In vitro, in vivo, and ex vivo. Chemical Science. 10 (34), 7835-7851 (2019).
- Pickens, C. J., Johnson, S. N., Pressnall, M. M., Leon, M. A., Berkland, C. J. Practical considerations, challenges, and limitations of bioconjugation via azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 29 (3), 686-701 (2018).
- Geng, Y., et al. Structural mechanism of ligand activation in human calcium-sensing receptor. Elife. 5, 13662 (2016).
