Detta protokoll beskriver en metod för eukaryot polysomrening från intakta sojabönor. Efter sekvensering kan standardpipelines för genuttrycksanalys användas för att identifiera differentiellt uttryckta gener på transkriptom- och translatomnivåerna.
Syftet med detta protokoll är att tillhandahålla en strategi för att studera det eukaryota överlatomet av sojabönan (Glycine max) symbiotisk knöl. Detta dokument beskriver metoder optimerade för att isolera växtbaserade polyribosomer och deras associerade mRNA som ska analyseras med RNA-sekvensering. Först erhålls cytoplasmatiska lysater genom homogenisering i polysom- och RNA-bevarande förhållanden från hela, frysta sojabönknutor. Därefter rensas lysater genom låghastighetscentrifugering, och 15% av supernatanten används för total RNA (TOTAL) isolering. Det återstående rensade lysatet används för att isolera polysomer genom ultracentrifugering genom en tvåskikts sackaroskudde (12% och 33,5%). Polysomassocierat mRNA (PAR) renas från polysomala pellets efter resuspension. Både TOTAL och PAR utvärderas av mycket känslig kapillärelektrofores för att uppfylla kvalitetsstandarderna för sekvenseringsbibliotek för RNA-seq. Som ett exempel på en nedströms applikation, efter sekvensering, kan standardrörledningar för genuttrycksanalys användas för att erhålla differentiellt uttryckta gener på transkriptom- och translatomnivåerna. Sammanfattningsvis möjliggör denna metod, i kombination med RNA-seq, studier av translationell reglering av eukaryota mRNA i en komplex vävnad såsom den symbiotiska knölen.
Baljväxter, såsom sojabönor (Glycine max), kan etablera symbios med specifika jordbakterier som kallas rhizobia. Detta mutualistiska förhållande framkallar bildandet av nya organ, de symbiotiska knölarna, på växtrötterna. Knölarna är växtorganen som är värd för bakterierna och består av värdceller vars cytoplasma koloniseras med en specialiserad form av rhizobia som kallas bakterioider. Dessa bakterioider katalyserar reduktionen av atmosfäriskt kväve (N2) till ammoniak, som överförs till växten i utbyte mot kolhydrater 1,2.
Även om denna kvävefixerande symbios är en av de mest välstuderade växt-mikrobsymbioserna, återstår många aspekter att förstå bättre, till exempel hur växter som utsätts för olika abiotiska stressförhållanden modulerar deras interaktion med sin symbiotiska partner och hur detta påverkar knölmetabolismen. Dessa processer kan förstås bättre genom att analysera knöltranslatomet (dvs. delmängden av budbärar-RNA [mRNA] som aktivt översätts). Polyribosomer eller polysomer är komplex av flera ribosomer associerade med mRNA, som vanligtvis används för att studera översättning3. Polysomprofileringsmetoden består av analys av mRNA associerade med polysomer och har framgångsrikt använts för att studera de posttranskriptionella mekanismerna som styr genuttryck som förekommer i olika biologiska processer 4,5.
Historiskt sett har genomuttrycksanalys främst fokuserat på att bestämma mRNA-överflöd 6,7,8,9. Det finns emellertid en brist på korrelation mellan transkript- och proteinnivåer på grund av de olika stadierna av posttranskriptionell reglering av genuttryck, särskilt översättning10,11,12. Dessutom har inget beroende observerats mellan förändringarna på transkriptomets nivå och de som uppträder vid translatomets nivå13. Den direkta analysen av den uppsättning mRNA som översätts möjliggör en mer exakt och fullständig mätning av cellgenuttrycket (vars slutpunkt är proteinmängd) än den som erhålls när endast mRNA-nivåer analyseras14,15,16.
Detta protokoll beskriver hur växtbaserade polysomer renas från intakta sojabönknutor genom differentiell centrifugering genom en tvåskikts sackaroskudde (figur 1). Men eftersom bakterioid-härledda ribosomer också finns i knölarna, renas en blandning av ribosomer och RNA-arter, även om de eukaryota representerar huvudfraktionen (90% -95%). Den efterföljande RNA-isoleringen, kvantifieringen och kvalitetskontrollen beskrivs också (figur 1). Detta protokoll, i kombination med RNA-seq, bör ge experimentella resultat om translationell reglering av eukaryota mRNA i en komplex vävnad såsom den symbiotiska knölen.
Figur 1: Schematisk översikt över den föreslagna metoden för eukaryot polysomrening från symbiotiska knölar. Schemat ger en översikt över de steg som följs i protokollet från (1) växttillväxt och (2) knölskörd till (3) beredning av cytosolextrakten, (3) erhållande av TOTAL-prover och (4) PAR-prover och (5) RNA-extraktion och kvalitetskontroll. Förkortningar: PEB = polysomextraktionsbuffert; RB = resuspensionsbuffert; TOTALT = totalt RNA; PAR = polysomassocierat mRNA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Att studera genuttrycksreglering på translationell nivå är avgörande för att bättre förstå olika biologiska processer eftersom slutpunkten för cellgenuttryck är proteinförekomst13,14. Detta kan bedömas genom att analysera translatomet hos vävnaden eller organismen av intresse för vilken den polysomala fraktionen ska renas och dess associerade mRNA analyseras 3,4,34,35,36.<sup clas…
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning finansierades av CSIC I + D 2020 bidrag nr 282, FVF 2017 bidrag nr 210 och PEDECIBA (María Martha Sainz).
Plant growth and rhizobia inoculation | |||
Orbital shaker | Daihan Scientific | Model SHO-1D | |
YEM-medium | Amresco | J850 (yeast extract) 0122 (mannitol) | |
Water deficit treatment | |||
KNO3 | Merck | 221295 | |
Porometer | Decagon Device | Model SC-1 | |
Scalpel | |||
Preparation of cytosolic extracts | |||
Brij L23 | Sigma-Aldrich | P1254 | |
Centrifuge | Sigma | Model 2K15 | |
Chloranphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
DOC | Sigma-Aldrich | 30970 | |
DTT | Sigma-Aldrich | D9779 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
Igepal CA 360 | Sigma-Aldrich | I8896 | |
KCl | Merck | 1.04936 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Plastic tissue grinder | Fisher Scientific | 12649595 | |
PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
PTE | Sigma-Aldrich | P2393 | |
Tris | Invitrogen | 15504-020 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Weighing dish | Deltalab | 1911103 | |
Preparation of sucrose cushions | |||
Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
SW 40 Ti rotor | Beckman-Coulter | ||
Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Optima L-100K | |
Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | 344059 | 13.2 mL tubes |
RNA extraction and quality control | |||
Agarose | Thermo scientific | R0492 | |
Bioanalyzer | Agilent | Model 2100. Eukaryote total RNA nano assay | |
Chloroform | DI | 41191 | |
Ethanol | Dorwil | UN1170 | |
Isopropanol | Mallinckrodt | 3032-06 | |
Glycogen | Sigma | 10814-010 | |
TRIzol LS | Ambion | 102960028 | |
Miscellaneous | |||
Falcon tubes 15 mL | Biologix | 10-0152 | |
Filter tips 10 µL | BioPointe Scientific | 321-4050 | |
Filter tips 1000 µL | BioPointe Scientific | 361-1050 | |
Filter tips 20 µL | BioPointe Scientific | 341-4050 | |
Filter tips 200 µL | Tarsons | 528104 | |
Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Tarsons | 500010-N | |
Microcentrifuge tubes 2.0 mL | Tarsons | 500020-N | |
Sequencing company | Macrogen | ||
Sterile 250 mL flask | Marienfeld | 4110207 |