Questo protocollo descrive la sintesi di peptidi ciclici penetranti nelle cellule con legami incrociati aromatici e la valutazione della loro permeabilità attraverso le barriere biologiche.
Articolo metodologico
Questo protocollo descrive la sintesi di peptidi ciclici penetranti nelle cellule con legami incrociati aromatici e la valutazione della loro permeabilità attraverso le barriere biologiche.
Il cancro è stato una grande sfida per la salute globale. Tuttavia, il complesso microambiente tumorale generalmente limita l'accesso delle terapie alle cellule tumorali più profonde, portando alla recidiva del tumore. Per superare la limitata penetrazione delle barriere biologiche, sono stati scoperti peptidi che penetrano le cellule (CPP) con un'eccellente capacità di traslocazione della membrana e sono emersi come utili trasportatori molecolari per trasportare vari carichi nelle cellule. Tuttavia, le CPP lineari convenzionali mostrano generalmente una stabilità proteolitica compromessa, che limita la loro permeabilità attraverso le barriere biologiche. Pertanto, lo sviluppo di nuovi trasportatori molecolari in grado di penetrare le barriere biologiche e mostrare una maggiore stabilità proteolitica è altamente desiderato per promuovere l'efficienza della somministrazione di farmaci nelle applicazioni biomediche. Abbiamo precedentemente sintetizzato un pannello di CPP ciclici corti con reticoli aromatici, che hanno mostrato una permeabilità superiore nelle cellule tumorali e nei tessuti rispetto alle loro controparti lineari. Qui, viene descritto un protocollo conciso per la sintesi del peptide poliarginina R8 ciclico marcato fluorescentmente e della sua controparte lineare, nonché i passaggi chiave per studiare la loro permeabilità cellulare.
Gli ultimi decenni hanno assistito a rapidi progressi nello sviluppo di peptidi che penetrano nelle cellule (CPP) per la somministrazione di farmaci. I CPP sono stati ampiamente utilizzati come trasportatori molecolari per il trattamento di una serie di malattie potenzialmente letali, tra cui disturbi neurologici1,2, malattie cardiache3, diabete4, dermatosi5 e cancro 6,7. Il cancro rimane un onere sanitario globale accompagnato da un alto tasso di morbilità e mortalità nonostante i....
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1. Preparazione dell'attrezzatura
NOTA: Eseguire tutte le procedure in una cappa aspirante funzionante con idonei dispositivi di protezione individuale.
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In questo protocollo, è stata presentata una procedura sintetica per vincolare la poliarginina lineare R8 nella sua forma ciclica. L'SPPS è stato condotto manualmente utilizzando un semplice apparato (Figura 1). Il processo sintetico dettagliato di SPPS è mostrato nella Figura 2. In breve, la resina è stata sufficientemente gonfiata, seguita dalla deprotezione del gruppo protettivo N α-Fmoc. Quindi, l'amminoacido protetto da N α-Fmoc .......
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La stabilizzazione chimica dei peptidi incorporando vincoli conformazionali si è dimostrata una strategia efficace per migliorare la stabilità e la permeabilità cellulare del peptide26. In questo protocollo, viene descritta una procedura passo-passo per la sintesi di CPP ciclici con legami incrociati aromatici e la valutazione della loro permeabilità attraverso barriere biologiche. Rispetto ai legami incrociati idrofili lattamici o triazolici22,27, l'incorporazione di legam.......
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Questo lavoro è supportato dalla Natural Science Foundation of China (21708031), dalla China Postdoctoral Science Foundation (BX20180264, 2018M643519) e dai fondi di ricerca fondamentale per le università centrali (2682021ZTPY075).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1,2-etanedithiol | Aladdin | K1722093 | puzza |
| 2-(7-Azobenzotriazolo)-N,N,N',N'-tetrametiluronio esafluorofosfato (HATU) | HEOWNS | A-0443697 | |
| 4,4'-bis(bromomethyl)biphenyl | TCI | B1921 | |
| 4T1 cells | ATCC | Le cellule 4T1 sono state coltivate in terreno DMEM integrato con il 10% di FBS (Hyclone) in un 37 ° C umidificato contenente il 5% di CO2. | |
| Acetonitrile | Adamas | 1484971 | tossicità |
| Diclorometano | Energia | W330229 | pelle dannosa |
| Etere dietilico | Aldrich | 673811 | infiammabile |
| Dimetil solfossido | Beyotime | ST038 | pelle dannosa |
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | ||
| Electrospray | Waters | G2-S Tof | |
| Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) | BioFroxx | 1340 | |
| Siero bovino fetale (FBS) | Citometro a flusso HyClone | ||
| Beckman Coulter | CytoFLEX | ||
| Isotiocianato di fluoresceina ( FITC) | Microscopio | a fluorescenza per E0801812500 | |
| Carl Zeiss | Axio Observer 7 | ||
| Fmoc-Arg(Pbf)-OH | HEOWNS | F-81070 | |
| Fmoc-Cys(Trt)-OH | GL Biochem | GLS201115-35202 | |
| Fmoc-β Cellule HeLa Ala-OH | Adamas | 51341C | |
| HeLa | ATCC | sono state coltivate in DMEM integrato con il 10% di FBS (Hyclone) in un 37 ° C umidificato contenente il 5% di CO2. | |
| Cromatografia liquida ad alte prestazioni | prestazioni Agilent | ||
| Poroshell EC-C18 120, 4,6 &volte; 150 mm (dimensione dei pori 120 & Aring;, dimensione delle particelle 4 & mu; m) | |||
| Liofilizzatore | SP Scientific | Vir Tis | |
| Metanolo | Aldrich | 9758 | tossicità |
| Piastra per microtitolazione | Thermo μ piastra a goccia | N12391 | |
| Morfolina | HEOWNS | M99040 | irritante |
| Lettore di micropiastre multitecnologico | Thermo | VARIOSKAN LUX | |
| N,N-Diisopropiletilammina | HEOWNS | E-81416 | irritante |
| N,N-Dimetil formammide | Energia | B020051 | dannoso per la pelle |
| Colonna Poly-Prep | Bio-Rad | 7321010 | colonne per cromatografia in polipropilene |
| Rink Amide Resina MBHA (0,572 mmol/g) | GL Biochem | GLS180301-49101 | |
| Rubinetti a tre vie | Bio-Rad | 7328107 | |
| Inserto per piastra per coltura tissutale | LABSELECT | 14211 | |
| Acido trifluoroacetico | HEOWNS | T63278 | corrosivo |
| Triisopropilsilano | HEOWNS | T-0284475 | |
| Tripsina | BioFroxx | 1004 | |
| Collettore per vuoto | Promega | A7231 |
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