生物学的障壁の浸透促進のための環状細胞透過性ペプチドの構築
Summary
このプロトコルでは、芳香族架橋を有する環状細胞透過性ペプチドの合成と、生物学的障壁を越えたそれらの透過性の評価について説明します。
Abstract
がんは、グローバルヘルスにおける大きな課題となっています。しかし、複雑な腫瘍微小環境は一般に、より深い腫瘍細胞への治療薬のアクセスを制限し、腫瘍の再発につながります。生物学的障壁の限られた浸透を克服するために、優れた膜移行能力を有する細胞透過性ペプチド(CPP)が発見され、様々な貨物を細胞内に送達するための有用な分子輸送体として浮上している。ただし、従来の線形CPPは一般にタンパク質分解安定性の低下を示し、生物学的障壁を越えた透過性が制限されます。したがって、生物学的障壁を貫通し、タンパク質分解安定性を高めることができる新規分子トランスポーターの開発は、生物医学的用途における薬物送達効率を促進するために強く望まれています。我々は以前、芳香族架橋を有する短い環状CPPのパネルを合成し、それらの線状対応物と比較して癌細胞および組織において優れた透過性を示した。ここでは、蛍光標識された環状ポリアルギニンR8ペプチドおよびその直鎖状対応物の合成、ならびにそれらの細胞透過性を調べるための重要なステップについて、簡潔なプロトコルについて説明します。
Introduction
過去数十年の間に、薬物送達用の細胞透過性ペプチド(CPP)の開発が急速に進歩してきました。CPPは、神経疾患1,2、心臓病3、糖尿病4、皮膚病5、および癌6,7を含む、生命を脅かすさまざまな疾患の治療のための分子輸送体として広く使用されています。がんは、広範な研究努力にもかかわらず、高い罹患率と死亡率を伴う世界的な健康上の負担であり続けています8。がん治療の深刻な障害は、コンパクトな細胞外マトリックス(ECM)、異常な腫瘍血管系、複数の膜バリア、高い間質液圧(IFP)などの生理学的障壁のために、より深い腫瘍細胞への治療薬のアクセスが制限されていることです9。したがって、生物学的障壁を越えて貨物を輸送する優れた能力を備えた新しいCPPを開発することは、癌治療に不可欠な戦略と考えられています10,11。
CPPは、物理化学的特性の観点から、カチオン性、両親媒性、疎水性のCPPに分類できます12。これらの中で、正に帯電したHIV-TATペプチドおよび合成ポリアルギニンは、生物医学研究において非常に重要であり、細胞内薬物送達を促進するために広く研究されている13。Tunnemannらは、R3〜R12ペプチドを用いて実施された細胞透過性試験に基づいて、合成ポリアルギニンペプチドの効率的な細胞浸透には最小長8個のアルギニンが不可欠であると報告した14。しかしながら、これらのCPPは、 一般に、in vivoで急速に加水分解するため、血漿半減期が短い。さらに、複数の細胞膜を貫通することは困難であるため、CPPのトランスバリア能を高めるためのCPPの化学構造の最適化についてはほとんど知られていない15。従って、薬物送達効率を高めるために生物学的障壁を透過することができる新規分子トランスポーターの開発が強く望まれている。2020年、Kominら16 は、上皮単層を通過するためのらせんモチーフ(RLLRLLR)とポリアルギニンテール(R7)を含むCLペプチドと呼ばれるCPPを発見しました。CLペプチド変異体のセットも、らせんパターンを改変することによって合成した。この探査は、生物学的障壁を越えて貨物を輸送するための新しいCPPの開発のための重要なガイドとなる可能性があります。さらに、DietrichらはStAXペプチドの細胞透過性を最適化し、ペプチドの全体的な疎水性を高めることによってWnt/β-カテニンシグナル伝達経路を阻害した17。
環化による非構造化直鎖状ペプチドの立体構造制限は、それらのタンパク質分解安定性および透過性を増強する有効な方法である18、19、20。構造強化は、環状ペプチドのプロテアーゼ耐性を増加させ、それらの線状対応物と比較してそれらをin vivoでより安定にする。加えて、ペプチドの環化は、分子内水素結合を促進することによって極性ペプチド骨格を潜在的にマスクすることができ、したがってペプチド21の膜透過性を増加させる。過去20年間で、化学選択的環化法は、全炭化水素、ラクタム、トリアゾール、m-キシレン、パーフルオロアリール、およびその他の架橋など、異なる構造を持つ環状ペプチドを構築するための効果的な戦略になりました22,23。洗練された腫瘍微小環境によって課せられる生物学的障壁は、固形腫瘍への薬物の浸透を減少させる可能性がある24。我々は以前に、環状CPPがそれらの線形対応物よりも酵素消化に対して優れた耐性を示すことを発見した20。さらに、ペプチドの全体的な疎水性は、それらの増強された細胞透過性にとって重要である22。上記の研究に基づいて、正に荷電したパターン、全体的な疎水性の上昇、およびタンパク質分解安定性の向上の組み合わせは、生物学的障壁を越えたCPPの透過性を高めると仮定することができます。最近の研究では、位置iおよびi+7に芳香族架橋を有する2つの環状CPPが同定され、それらの線形対応物と比較して腫瘍細胞および組織における透過性が改善されている15。ここでは、蛍光標識された環状CPPを合成するための簡潔な合成プロトコルと、それらの透過性を調べるための重要なステップを示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
立体配座制約を組み込むことによるペプチドの化学的安定化は、ペプチド26の安定性および細胞透過性を改善するための有効な戦略であることが証明されている。このプロトコルでは、芳香族架橋を有する環状CPPの合成および生物学的障壁を越えたそれらの透過性の評価のための段階的な手順が説明されている。親水性ラクタムまたはトリアゾール架橋22,27…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国自然科学基金会(21708031)、中国ポスドク科学基金会(BX20180264、2018M643519)、および中央大学の基礎研究基金(2682021ZTPY075)の支援を受けています。
Materials
| 1,2-ethanedithiol | Aladdin | K1722093 | stench |
| 2-(7-Azobenzotriazole)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) | HEOWNS | A-0443697 | |
| 4,4'-bis(bromomethyl)biphenyl | TCI | B1921 | |
| 4T1 cells | ATCC | 4T1 cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2. | |
| Acetonitrile | Adamas | 1484971 | toxicity |
| Dichloromethane | Energy | W330229 | skin harmful |
| Diethyl ether | Aldrich | 673811 | flammable |
| Dimethyl sulfoxide | Beyotime | ST038 | skin harmful |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | ||
| Electrospray Ionization Mass Spectrometer | Waters | G2-S Tof | |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | BioFroxx | 1340 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | ||
| Flow cytometer | Beckman Coulter | CytoFLEX | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer (FITC) | Energy | E0801812500 | |
| Fluorescent microscope | Carl Zeiss | Axio Observer 7 | |
| Fmoc-Arg(Pbf)-OH | HEOWNS | F-81070 | |
| Fmoc-Cys(Trt)-OH | GL Biochem | GLS201115-35202 | |
| Fmoc-βAla-OH | Adamas | 51341C | |
| HeLa cells | ATCC | HeLa cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2. | |
| High-Performance Liquid Chromatography | Agilent | Agilent 1260 | |
| High-Performance Liquid Chromatography column | Agilent | Poroshell EC-C18 120, 4.6 × 150 mm (pore size 120 Å, particle size 4 μm) | |
| Lyophilizer | SP Scientific | Vir Tis | |
| Methanol | Aldrich | 9758 | toxicity |
| Microtiter plate | Thermo μdrop plate | N12391 | |
| Morpholine | HEOWNS | M99040 | irritant |
| Multi-technology microplate reader | Thermo | VARIOSKAN LUX | |
| N,N-Diisopropylethylamine | HEOWNS | E-81416 | irritant |
| N,N-Dimethyl formamide | Energy | B020051 | harmful to skin |
| Poly-Prep column | Bio-Rad | 7321010 | polypropylene chromatography columns |
| Rink Amide MBHA resin (0.572 mmol/g) | GL Biochem | GLS180301-49101 | |
| Three-way stopcocks | Bio-Rad | 7328107 | |
| Tissue culture plate insert | LABSELECT | 14211 | |
| Trifluoroacetic acid | HEOWNS | T63278 | corrosive |
| Triisopropylsilane | HEOWNS | T-0284475 | |
| Trypsin | BioFroxx | 1004 | |
| Vacuum manifold | Promega | A7231 |
Riferimenti
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