Costruzione di peptidi ciclici che penetrano nelle cellule per una maggiore penetrazione delle barriere biologiche

Summary

Questo protocollo descrive la sintesi di peptidi ciclici penetranti nelle cellule con legami incrociati aromatici e la valutazione della loro permeabilità attraverso le barriere biologiche.

Abstract

Il cancro è stato una grande sfida per la salute globale. Tuttavia, il complesso microambiente tumorale generalmente limita l’accesso delle terapie alle cellule tumorali più profonde, portando alla recidiva del tumore. Per superare la limitata penetrazione delle barriere biologiche, sono stati scoperti peptidi che penetrano le cellule (CPP) con un’eccellente capacità di traslocazione della membrana e sono emersi come utili trasportatori molecolari per trasportare vari carichi nelle cellule. Tuttavia, le CPP lineari convenzionali mostrano generalmente una stabilità proteolitica compromessa, che limita la loro permeabilità attraverso le barriere biologiche. Pertanto, lo sviluppo di nuovi trasportatori molecolari in grado di penetrare le barriere biologiche e mostrare una maggiore stabilità proteolitica è altamente desiderato per promuovere l’efficienza della somministrazione di farmaci nelle applicazioni biomediche. Abbiamo precedentemente sintetizzato un pannello di CPP ciclici corti con reticoli aromatici, che hanno mostrato una permeabilità superiore nelle cellule tumorali e nei tessuti rispetto alle loro controparti lineari. Qui, viene descritto un protocollo conciso per la sintesi del peptide poliarginina R8 ciclico marcato fluorescentmente e della sua controparte lineare, nonché i passaggi chiave per studiare la loro permeabilità cellulare.

Introduction

Gli ultimi decenni hanno assistito a rapidi progressi nello sviluppo di peptidi che penetrano nelle cellule (CPP) per la somministrazione di farmaci. I CPP sono stati ampiamente utilizzati come trasportatori molecolari per il trattamento di una serie di malattie potenzialmente letali, tra cui disturbi neurologici^1,2, malattie cardiache³, diabete⁴, dermatosi⁵ e cancro ^6,7. Il cancro rimane un onere sanitario globale accompagnato da un alto tasso di morbilità e mortalità nonostante i diffusi sforzi di ricerca⁸. Un serio ostacolo al trattamento del cancro è l’accesso limitato delle terapie alle cellule tumorali più profonde a causa di barriere fisiologiche come la matrice extracellulare compatta (ECM), la vascolarizzazione tumorale anormale, le barriere multimembrana e l’alta pressione del liquido interstiziale (IFP)⁹. Pertanto, lo sviluppo di nuovi CPP con una capacità superiore di consegnare carichi attraverso le barriere biologiche è considerato una strategia essenziale per il trattamento del cancro^10,11.

I CPP possono essere classificati in CPP cationici, anfipatici e idrofobici in termini di proprietà fisico-chimiche¹². Tra questi, il peptide HIV-TAT caricato positivamente e la poliarginina sintetica sono di notevole importanza nella ricerca biomedica e sono stati ampiamente studiati per facilitare la somministrazione intracellulare di farmaci¹³. Tunnemann et al. hanno riferito che una lunghezza minima di otto arginine è essenziale per un’efficiente penetrazione cellulare dei peptidi sintetici di poliarginina, sulla base di uno studio di permeabilità cellulare condotto utilizzando i peptidi da R3 a R12¹⁴. Tuttavia, questi CPP hanno generalmente brevi emivite plasmatiche a causa della loro rapida idrolisi in vivo. Inoltre, si sa poco per quanto riguarda l’ottimizzazione della struttura chimica dei CPP per aumentare la loro capacità di trans-barriera in quanto è difficile penetrare più membrane cellulari¹⁵. Pertanto, lo sviluppo di nuovi trasportatori molecolari in grado di penetrare le barriere biologiche è fortemente desiderato per migliorare l’efficienza della somministrazione dei farmaci. Nel 2020, Komin et ^al.16 hanno scoperto un CPP chiamato peptide CL, che contiene un motivo elicoidale (RLLRLLR) e una coda di poliarginina (R7) per attraversare il monostrato epiteliale. Una serie di varianti peptidiche CL sono state anche sintetizzate alterando il modello elicoidale. Questa esplorazione potrebbe essere una guida significativa per lo sviluppo di nuovi CPP per la consegna di carichi attraverso barriere biologiche. Inoltre, Dietrich et al. hanno ottimizzato la permeabilità cellulare del peptide StAX, inibendo la via di segnalazione Wnt / β-catenina aumentando l’idrofobicità complessiva dei peptidi¹⁷.

La restrizione conformazionale di peptidi lineari non strutturati mediante ciclizzazione è un modo efficace per migliorare la loro stabilità proteolitica e permeabilità^18,19,20. Il rinforzo strutturale aumenta la resistenza alla proteasi dei peptidi ciclici, rendendoli più stabili in vivo rispetto alle loro controparti lineari. Inoltre, la ciclizzazione dei peptidi può potenzialmente mascherare la spina dorsale del peptide polare promuovendo il legame idrogeno intramolecolare, aumentando così la permeabilità della membrana dei peptidi²¹. Negli ultimi due decenni, i metodi di ciclizzazione chemioselettiva sono diventati strategie efficaci per la costruzione di peptidi ciclici con architetture diverse, come tutto idrocarburi, lattamici, triazolo, m-xilene, perfluoroarile e altri legami incrociati^22,23. La barriera biologica imposta dal sofisticato microambiente tumorale potrebbe ridurre la penetrazione dei farmaci nei tumori solidi²⁴. Abbiamo precedentemente scoperto che i CPP ciclici mostravano una resistenza superiore alla digestione enzimatica rispetto alle loro controparti lineari²⁰. Inoltre, l’idrofobicità complessiva dei peptidi è fondamentale per la loro maggiore permeabilità cellulare²². Sulla base degli studi discussi sopra, la combinazione di un modello caricato positivamente, elevata idrofobicità complessiva e maggiore stabilità della proteolisi può essere ipotizzata per aumentare la permeabilità dei CPP attraverso le barriere biologiche. In uno studio recente, abbiamo identificato due CPP ciclici con legami incrociati aromatici nelle posizioni i e i + 7 che mostrano una migliore permeabilità nelle cellule e nei tessuti tumorali rispetto alle loro controparti lineari¹⁵. Qui viene presentato un protocollo sintetico conciso per la sintesi di CPP ciclici marcati con fluorescenza e i passaggi chiave per studiarne la permeabilità.

Protocol

1. Preparazione dell’attrezzatura NOTA: Eseguire tutte le procedure in una cappa aspirante funzionante con idonei dispositivi di protezione individuale. Assemblare l’apparato manuale di sintesi dei peptidi nella cappa aspirante (Figura 1). Posizionare i rubinetti di arresto a tre vie (vedi tabella dei materiali) sul collettore a vuoto (vedere tabella dei materiali) e collegarli all’azoto (N2)….

Representative Results

In questo protocollo, è stata presentata una procedura sintetica per vincolare la poliarginina lineare R8 nella sua forma ciclica. L’SPPS è stato condotto manualmente utilizzando un semplice apparato (Figura 1). Il processo sintetico dettagliato di SPPS è mostrato nella Figura 2. In breve, la resina è stata sufficientemente gonfiata, seguita dalla deprotezione del gruppo protettivo N α-Fmoc. Quindi, l’amminoacido protetto da N α…

Discussion

La stabilizzazione chimica dei peptidi incorporando vincoli conformazionali si è dimostrata una strategia efficace per migliorare la stabilità e la permeabilità cellulare del peptide²⁶. In questo protocollo, viene descritta una procedura passo-passo per la sintesi di CPP ciclici con legami incrociati aromatici e la valutazione della loro permeabilità attraverso barriere biologiche. Rispetto ai legami incrociati idrofili lattamici o triazolici^22,27, l’incorporazione di l…

Materials

1,2-ethanedithiol	Aladdin	K1722093	stench
2-(7-Azobenzotriazole)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU)	HEOWNS	A-0443697
4,4'-bis(bromomethyl)biphenyl	TCI	B1921
4T1 cells	ATCC		4T1 cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2.
Acetonitrile	Adamas	1484971	toxicity
Dichloromethane	Energy	W330229	skin harmful
Diethyl ether	Aldrich	673811	flammable
Dimethyl sulfoxide	Beyotime	ST038	skin harmful
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco
Electrospray Ionization Mass Spectrometer	Waters	G2-S Tof
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)	BioFroxx	1340
Fetal bovine serum (FBS)	HyClone
Flow cytometer	Beckman Coulter	CytoFLEX
Fluorescein isothiocyanate isomer (FITC)	Energy	E0801812500
Fluorescent microscope	Carl Zeiss	Axio Observer 7
Fmoc-Arg(Pbf)-OH	HEOWNS	F-81070
Fmoc-Cys(Trt)-OH	GL Biochem	GLS201115-35202
Fmoc-βAla-OH	Adamas	51341C
HeLa cells	ATCC		HeLa cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2.
High-Performance Liquid Chromatography	Agilent	Agilent 1260
High-Performance Liquid Chromatography column	Agilent	Poroshell EC-C18 120, 4.6 × 150 mm (pore size 120 Å, particle size 4 μm)
Lyophilizer	SP Scientific	Vir Tis
Methanol	Aldrich	9758	toxicity
Microtiter plate	Thermo μdrop plate	N12391
Morpholine	HEOWNS	M99040	irritant
Multi-technology microplate reader	Thermo	VARIOSKAN LUX
N,N-Diisopropylethylamine	HEOWNS	E-81416	irritant
N,N-Dimethyl formamide	Energy	B020051	harmful to skin
Poly-Prep column	Bio-Rad	7321010	polypropylene chromatography columns
Rink Amide MBHA resin (0.572 mmol/g)	GL Biochem	GLS180301-49101
Three-way stopcocks	Bio-Rad	7328107
Tissue culture plate insert	LABSELECT	14211
Trifluoroacetic acid	HEOWNS	T63278	corrosive
Triisopropylsilane	HEOWNS	T-0284475
Trypsin	BioFroxx	1004
Vacuum manifold	Promega	A7231