Denne protokollen beskriver syntesen av sykliske cellepenetrerende peptider med aromatiske tverrbindinger og evalueringen av deres permeabilitet over biologiske barrierer.
Kreft har vært en stor utfordring i global helse. Imidlertid begrenser det komplekse tumormikromiljøet generelt terapiens tilgang til dypere tumorceller, noe som fører til tilbakefall av svulster. For å erobre den begrensede penetrasjonen av biologiske barrierer, har cellepenetrerende peptider (CPP) blitt oppdaget med utmerket membrantranslokasjonsevne og har dukket opp som nyttige molekylære transportører for å levere forskjellige laster inn i celler. Imidlertid viser konvensjonelle lineære CPP-er generelt kompromittert proteolytisk stabilitet, noe som begrenser permeabiliteten på tvers av biologiske barrierer. Dermed er utviklingen av nye molekylære transportører som kan trenge gjennom biologiske barrierer og utvise forbedret proteolytisk stabilitet sterkt ønsket for å fremme legemiddelleveringseffektivitet i biomedisinske applikasjoner. Vi har tidligere syntetisert et panel av korte sykliske CPP med aromatiske tverrbindinger, som viste overlegen permeabilitet i kreftceller og vev sammenlignet med deres lineære kolleger. Her er en kortfattet protokoll beskrevet for syntesen av det fluorescerende merkede sykliske polyarginin R8-peptidet og dets lineære motstykke, samt viktige trinn for å undersøke cellepermeabiliteten.
De siste tiårene har vært vitne til raske fremskritt i utviklingen av cellepenetrerende peptider (CPP) for legemiddellevering. CPP har blitt mye brukt som molekylære transportører for behandling av en rekke livstruende sykdommer, inkludert nevrologiske lidelser1,2, hjertesykdommer3, diabetes4, dermatose5 og kreft 6,7. Kreft er fortsatt en global helsebyrde ledsaget av høy sykelighet og dødelighet til tross for omfattende forskningsinnsats8. En alvorlig hindring for behandling av kreft er terapeutikkens begrensede tilgang til dypere tumorceller på grunn av fysiologiske barrierer som kompakt ekstracellulær matrise (ECM), unormal tumorvaskulatur, flere membranbarrierer og høyt interstitielt væsketrykk (IFP)9. Utvikling av nye CPP-er med overlegen evne til å levere last på tvers av biologiske barrierer anses derfor som en viktig strategi for kreftbehandling10,11.
CPP kan kategoriseres i kationiske, amfipatiske og hydrofobe CPP når det gjelder deres fysisk-kjemiske egenskaper12. Blant disse er det positivt ladede HIV-TAT-peptidet og det syntetiske polyargininet av stor betydning i biomedisinsk forskning og har blitt grundig studert for å lette intracellulær legemiddellevering13. Tunnemann et al. rapporterte at en minimumslengde på åtte argininer er avgjørende for effektiv cellepenetrasjon av de syntetiske polyargininpeptidene, basert på en cellepermeabilitetsstudie utført ved bruk av R3 til R12-peptider14. Imidlertid har disse CPP-ene generelt korte halveringstider i plasma på grunn av deres raske hydrolyse in vivo. I tillegg er lite kjent om optimalisering av den kjemiske strukturen til CPP for å øke deres transbarriereevne, da det er utfordrende å trenge gjennom flere cellemembraner15. Dermed er utviklingen av nye molekylære transportører som er i stand til å trenge gjennom biologiske barrierer, sterkt ønsket for å forbedre legemiddelleveringseffektiviteten. I 2020 oppdaget Komin et al.16 et CPP kalt CL-peptid, som inneholder et helixmotiv (RLLRLLR) og en polyargininhale (R7) for å krysse epitelmonolaget. Et sett med CL-peptidvarianter ble også syntetisert ved å endre det spiralformede mønsteret. Denne utforskningen kan være en betydelig veiledning for utviklingen av nye CPP-er for levering av last over biologiske barrierer. Videre optimaliserte Dietrich et al. cellepermeabiliteten til StAX-peptidet, og hemmet Wnt / β-catenin-signalveien ved å øke den totale hydrofobisiteten til peptidene17.
Konformasjonsbegrensning av ustrukturerte lineære peptider ved syklisering er en effektiv måte å forbedre deres proteolytiske stabilitet og permeablitet18,19,20. Den strukturelle forsterkningen øker proteasemotstanden til sykliske peptider, noe som gjør dem mer stabile in vivo sammenlignet med deres lineære kolleger. I tillegg kan sykliseringen av peptider potensielt maskere den polare peptidryggraden ved å fremme intramolekylær hydrogenbinding, og dermed øke membranpermeabiliteten til peptidene21. I løpet av de siste to tiårene har kjemoselektive sykliseringsmetoder blitt effektive strategier for konstruksjon av sykliske peptider med forskjellige arkitekturer, som all-hydrokarbon, laktam, triazol, m-xylen, perfluoroaryl og andre tverrbindinger22,23. Den biologiske barrieren pålagt av det sofistikerte tumormikromiljøet kan redusere penetrasjonen av legemidler i faste svulster24. Vi har tidligere funnet at de sykliske CPP-ene viste overlegen motstand mot enzymatisk fordøyelse over sine lineære kolleger20. Videre er den totale hydrofobisiteten til peptidene kritisk for deres forbedrede cellepermeabilitet22. Basert på studiene diskutert ovenfor, kan kombinasjonen av et positivt ladet mønster, forhøyet total hydrofobicitet og forbedret proteolysestabilitet antas å øke permeabiliteten til CPP på tvers av biologiske barrierer. I en nylig studie identifiserte vi to sykliske CPP med aromatiske tverrbindinger i posisjon i og i + 7 som viser forbedret permeabilitet i tumorceller og vev sammenlignet med deres lineære kolleger15. Her presenteres en kortfattet syntetisk protokoll for syntese av fluorescerende merkede sykliske CPP og de viktigste trinnene for å undersøke deres permeabilitet.
Den kjemiske stabiliseringen av peptider ved å inkorporere konformasjonsbegrensninger har vist seg å være en effektiv strategi for å forbedre stabiliteten og cellepermeabiliteten til peptidet26. I denne protokollen er en trinnvis prosedyre beskrevet for syntese av sykliske CPP med aromatiske tverrbindinger og evaluering av deres permeabilitet over biologiske barrierer. Sammenlignet med de hydrofile laktam- eller triazol-tverrbindingene22,27, forbedrer inkorporeringen av…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet støttes av Natural Science Foundation of China (21708031), China Postdoctoral Science Foundation (BX20180264, 2018M643519) og Fundamental Research Funds for the Central Universities (2682021ZTPY075).
1,2-ethanedithiol | Aladdin | K1722093 | stench |
2-(7-Azobenzotriazole)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) | HEOWNS | A-0443697 | |
4,4'-bis(bromomethyl)biphenyl | TCI | B1921 | |
4T1 cells | ATCC | 4T1 cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2. | |
Acetonitrile | Adamas | 1484971 | toxicity |
Dichloromethane | Energy | W330229 | skin harmful |
Diethyl ether | Aldrich | 673811 | flammable |
Dimethyl sulfoxide | Beyotime | ST038 | skin harmful |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | ||
Electrospray Ionization Mass Spectrometer | Waters | G2-S Tof | |
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | BioFroxx | 1340 | |
Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | ||
Flow cytometer | Beckman Coulter | CytoFLEX | |
Fluorescein isothiocyanate isomer (FITC) | Energy | E0801812500 | |
Fluorescent microscope | Carl Zeiss | Axio Observer 7 | |
Fmoc-Arg(Pbf)-OH | HEOWNS | F-81070 | |
Fmoc-Cys(Trt)-OH | GL Biochem | GLS201115-35202 | |
Fmoc-βAla-OH | Adamas | 51341C | |
HeLa cells | ATCC | HeLa cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2. | |
High-Performance Liquid Chromatography | Agilent | Agilent 1260 | |
High-Performance Liquid Chromatography column | Agilent | Poroshell EC-C18 120, 4.6 × 150 mm (pore size 120 Å, particle size 4 μm) | |
Lyophilizer | SP Scientific | Vir Tis | |
Methanol | Aldrich | 9758 | toxicity |
Microtiter plate | Thermo μdrop plate | N12391 | |
Morpholine | HEOWNS | M99040 | irritant |
Multi-technology microplate reader | Thermo | VARIOSKAN LUX | |
N,N-Diisopropylethylamine | HEOWNS | E-81416 | irritant |
N,N-Dimethyl formamide | Energy | B020051 | harmful to skin |
Poly-Prep column | Bio-Rad | 7321010 | polypropylene chromatography columns |
Rink Amide MBHA resin (0.572 mmol/g) | GL Biochem | GLS180301-49101 | |
Three-way stopcocks | Bio-Rad | 7328107 | |
Tissue culture plate insert | LABSELECT | 14211 | |
Trifluoroacetic acid | HEOWNS | T63278 | corrosive |
Triisopropylsilane | HEOWNS | T-0284475 | |
Trypsin | BioFroxx | 1004 | |
Vacuum manifold | Promega | A7231 |