مقايسة ربط بروتين سطح الخلية القائمة على قياس التدفق الخلوي لتقييم انتقائية وخصوصية أبتامير مضاد للسرطان
Summary
الخطوة الضرورية في تطوير أبتامير مضاد للسرطان هي اختبار ارتباطه بالهدف. نعرض مقايسة قائمة على التدفق الخلوي لدراسة هذا الارتباط ، مع التأكيد على أهمية تضمين أبتامير التحكم السلبي والخلايا السرطانية الإيجابية أو السلبية لهذا البروتين المعين.
Abstract
يتمثل التحدي الرئيسي في تطوير أبتامير مضاد للسرطان في تحديد انتقائية وخصوصية الأبتامير المطور للبروتين المستهدف بكفاءة. نظرا لمزاياه العديدة على الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ، اكتسب تطوير aptamer شعبية هائلة بين الباحثين في مجال السرطان. التطور المنهجي للروابط عن طريق التخصيب الأسي (SELEX) هو الطريقة الأكثر شيوعا لتطوير أبتامير خاصة بالبروتينات ذات الأهمية. بعد SELEX ، يؤدي فحص الربط السريع والفعال إلى تسريع عملية تحديد الهوية ، مما يؤكد انتقائية وخصوصية aptamer.
تشرح هذه الورقة مقايسة الربط القائمة على القياس الخلوي للتدفق خطوة بخطوة ل aptamer الخاص بجزيء الالتصاق الخلوي الظهاري (EpCAM). يتم التعبير عن البروتين السكري عبر الغشاء EpCAM بشكل مفرط في معظم السرطانات ويلعب أدوارا في بدء السرطان وتقدمه وورم خبيث. لذلك ، فهو مرشح قيم لتوصيل الدواء المستهدف إلى الأورام. لتقييم انتقائية وخصوصية الأبتامير إلى EpCAM المرتبط بالغشاء ، يلزم وجود خلايا إيجابية وسالبة EpCAM. بالإضافة إلى ذلك ، يلزم وجود أبتامير EpCAM غير ملزم بطول مماثل وبنية ثنائية الأبعاد (2D) ل aptamer المرتبط ب EpCAM. يتضمن فحص الربط مخازن مؤقتة مختلفة (المخزن المؤقت للحظر ، ومخزن الغسيل ، ومخزن الحضانة ، ومخزن FACS) وخطوات الحضانة.
يتم تحضين الأبتامير مع خطوط الخلية. بعد خطوات الحضانة والغسيل ، سيتم تقييم الخلايا باستخدام اختبار قياس التدفق الخلوي الحساس. يظهر تحليل النتائج ارتباط الأبتامير الخاص ب EpCAM بالخلايا الإيجابية ل EpCAM وليس الخلايا السلبية ل EpCAM. في الخلايا الإيجابية ل EpCAM ، يتم تصوير هذا على أنه تحول في النطاق في ربط EpCAM aptamer إلى اليمين مقارنة بعنصر تحكم aptamer غير الملزم. في الخلايا السالبة ل EpCAM ، تتداخل النطاقات المقابلة من aptamers المرتبطة ب EpCAM وغير الملزمة. يوضح هذا انتقائية وخصوصية أبتامر EpCAM. بينما يركز هذا البروتوكول على أبتامير EpCAM ، فإن البروتوكول ينطبق على الأبتامير المنشورة الأخرى.
Introduction
لا يزال السرطان أحد الأسباب الرئيسية للوفيات في جميع أنحاء العالم1. على الرغم من التحسن الكبير في علاج السرطان في العقود الأخيرة ، لا يزال تطوير الأدوية المضادة للسرطان موضوعا مثيرا للجدل. وذلك لأن العلاج الكيميائي ، باعتباره الدعامة الأساسية لعلاج السرطان ، يصاحبه آثار جانبية خطيرة تحد من امتثال المريض للعلاج. علاوة على ذلك ، فإن مقاومة السرطان التي يسببها العلاج الكيميائي قد قيدت تطبيقه كخيار وحيد للتدخل الطبي. قدم تطبيق الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (mAbs) استجابة معززة لعلاجات السرطان2. كان الأساس المنطقي لاستخدام mAbs هو تحسين فعالية العلاج الكيميائي وتقليل ردود الفعل السلبية. ومع ذلك ، أصبحت إدارة mAbs أيضا تحديا. لم يكن هذا فقط بسبب التفاعلات المناعية التي يسببها mAb ولكن أيضا بسبب تكاليف الإنتاج المكلفة التي تعتمد على الحيوانات وظروف التخزين الصعبة3. أثار إدخال aptamers في 1990s4 آمالا جديدة في علاج السرطان ، حيث أن تطبيق aptamers يمكن أن يعالج التحديات المرتبطة ب mAbs.
Aptamers هي تسلسلات قصيرة من الحمض النووي يتم إنتاجها خصيصا لهدف معين. التطور المنهجي للروابط عن طريق التخصيب الأسي (SELEX) هو طريقة شائعة في إنتاج الأبتامير. في SELEX ، يتم تحضين البروتين محل الاهتمام بمكتبة من تسلسلات النوكليوتيدات العشوائية ، ومن خلال سلسلة من الدورات التكرارية ، يتم تنقية الأبتامير المحدد لهذا البروتين. لدى Aptamers انتقائية وخصوصية مستهدفة مماثلة ل mAbs ، وبالتالي فإن تطوير الأدوية في هذا المجال يظهر تطبيقات مستقبلية واعدة. يمكن تطبيق Aptamers الخاصة بالمؤشرات الحيوية للسرطان كأدوية مفردة وأدوات تشخيص السرطان5،6،7. نظرا لهيكلها بحجم النانو ، يمكن أن تعمل هذه الأبتامير أيضا كحاملات أدوية لتوصيل العوامل السامة للخلايا على وجه التحديد إلى الورم8. هذا من شأنه أن يزيد من فعالية توصيل الدواء المستهدف ويقلل من ردود الفعل السلبية المرتبطة بالعلاج الكيميائي وغير المستهدفة. علاوة على ذلك ، تتمتع هذه الأدوية النانوية باختراق كبير للأنسجة ، مما يجعلها مرشحا مرغوبا لتوصيل أدوية الأورام العميقة وعلاجها. يمكن أيضا تصميم Aptamers لاستهداف الناقلات المعبر عنها على الحاجز الدموي الدماغي (BBB) لتحسين توصيل الدواء إلى أورام المخ9. وخير مثال على مثل هذا الأبتامير هو الأبتامير ثنائي الوظيفة ، الذي يستهدف مستقبلات الترانسفيرين (TfR) 10 لتعزيز توصيل الدواء عبر BBB ، وتوصيل حمولة دواء سامة للخلايا إلى الخلايا السرطانية11.
على الرغم من كل مزايا aptamers ، فإن تطوير الأدوية في هذا المجال لم يسفر بعد عن دواء مضاد للسرطان ناجح وناجح. قد يكون أحد أسباب ذلك هو عدم وجود طرق قياسية وقابلة للتكرار يمكن اتباعها عالميا من قبل الباحثين في هذا المجال. في هذه الورقة ، يتم توضيح بروتوكول خطوة بخطوة لارتباط الأبتامير ببروتين أصلي معبر عنه على سطح الخلية. هذا البروتوكول هو خطوة أساسية في التقييم قبل السريري للأبتامير المضادة للسرطان. يتم إجراء الفحص لإظهار انتقائية وخصوصية الأبتامير المنقى الذي تم جمعه من SELEX أو تسلسل أبتامير منشور لتأكيد الانتقائية والنوعية. هذا الفحص القائم على التدفق الخلوي هو اختبار سريع وموثوق وحساس يظهر بدقة انتقائية وخصوصية الأبتامير ، حيث يتم اختبار الأبتامير ضد البروتينات الموجودة على سطح الخلية12،13،14. يتم توضيح هذه الطريقة باستخدام ربط أبتامير خاص ب EpCAM الموضح في هذه الورقة15. يلعب EpCAM ، باعتباره بروتين سكري عبر الغشاء ، أدوارا في إشارات الخلايا السرطانية ، والتقدم ، والهجرة ، وورم خبيث16,17. لإظهار انتقائية وخصوصية هذا الأبتامر ، تم استخدام الخلايا السرطانية الإيجابية والسالبة EpCAM. تم استخدام aptamer الخاص ب EpCAM الذي تم تطويره مسبقا ، TEPP (5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′) ، و aptamer للتحكم السلبي ، TENN (5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3) ، كأبتامير ملزمة وغير ملزمة ل EpCAM ، على التوالي10. تم تمييز الطرف 3 ‘لكل من TEPP و TENN بفلوروفور TYE665.
TEPP هو أبتامير ثنائي الوظيفة يستهدف EpCAM من طرف و TfR من جهة أخرى. وقد جعل هذا TEPP مرشحا مناسبا لتوصيل الدواء إلى أورام الدماغ EpCAM + . باستخدام نهايته الخاصة ب TfR ، يجتاز TEPP الحاجز الدموي الدماغي ، وباستخدام الطرف الخاص ب EpCAM ، يجد الورم ويسلم حمولته (على سبيل المثال ، الأدوية السامة للخلايا) إلى الورم. TENN له طول مماثل وهيكل 2D مثل TEPP ، ولكن ليس لديه تقارب ل EpCAM أو TfR ، وبالتالي فهو aptamer التحكم السلبي المناسب. باستخدام TEPP و TENN ، يظهر اختبار ارتباط الأبتامير بالبروتين المستهدف باستخدام قياس التدفق الخلوي في هذه الورقة. ينطبق هذا البروتوكول على تطوير aptamers الخاصة بالخلية. كما أنه ينطبق على المزيد من التحليلات التكميلية والتأكيدية لتسلسل الأبتامير المتاح في الأدبيات. يمكن أيضا استخدام البروتوكول من قبل أولئك الجدد في مجال أبتامير الذين يبحثون في استخدام أبتامير منشور مسبقا لأغراض البحث والتطوير (R&D). في هذه الورقة ، تمت دراسة تسلسلين أبتامير متاحين في الأدبيات.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتمثل التحدي الرئيسي في تطوير أبتامرز جديدة في عدم وجود مبادئ توجيهية قياسية تنطبق على خطوات مختلفة من هذه العملية. أظهر McKeague et al. مؤخرا بعض التحديات المرتبطة بها ، والتي تؤدي إلى عروض غير واضحة للبيانات في المنشورات والفشل في تكرار البحث. واقترحوا مبادئ توجيهية أساسية ضرورية للنظر فيها ف?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يقر المؤلفون بتمويل SEED من معهد الصحة العقلية والبدنية والترجمة السريرية (IMPACT) ، وبرنامج “زمالة ألفريد ديكين لأبحاث ما بعد الدكتوراه” في جامعة ديكين ، و “منحة برنامج التدريب البحثي للحكومة الأسترالية”.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes with attached lid | Sigma-Aldrich | T6649 | |
| 15 mL CellStar blue screw cap, conical bottom tube | Greiner Bio One | 188271 | |
| 5 mL serological pipettes | Greiner Bio One | 606180 | |
| BD FACSCanto II Flow Becton Dickinson Cytometer | Becton Dickinson | N/A | |
| BD FACSDiva V9.0 | BD Biosciences | N/A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Lyophilized powder | Sigma-AldrichTM | A7906-50G | |
| Bright-line Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose Media Powder | Life Technologies | 12100046 | |
| Dulbecco’s Phosphate- Buffered Saline (DPBS) | Life Technologies | 21300025 | |
| FlowJo, LLC 10.8.1 | BD Biosciences | N/A | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
| HEK293T | American Type Culture Collection | ACS-4500 | |
| Heracell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Heraeus Megafuge 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
| Microplate, PS, 96 well, F-bottom (Chimney well), Black | Greiner Bio One | 655076 | |
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) tablets | Life Technologies | 18912014 | |
| Pyrogen- and RNase-free ultrapure water | Milli-Q | ||
| T75 Cell Culture flask | Cellstar | 658170 | |
| TENN | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3 |
| TEPP | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′ |
| Transfer RNA (tRNA) | Sigma-Aldrich | R8508-5X1ML | |
| Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 |
Riferimenti
- Cancer. World Health Organization Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20is%20a%20leading%20cause.and%20rectum%20and%20prostate%20cancers (2022)
- Liu, J. K. H. The history of monoclonal antibody development – Progress, remaining challenges and future innovations. Annals of Medicine and Surgery. 3 (4), 113-116 (2014).
- Nakhjavani, M., Shigdar, S. Future of PD-1/PD-L1 axis modulation for the treatment of triple-negative breast cancer. Pharmacological Research. 175, 106019 (2022).
- Bukari, B., Samarasinghe, R. M., Noibanchong, J., Shigdar, S. L. Non-invasive delivery of therapeutics into the brain: the potential of aptamers for targeted delivery. Biomedicines. 8 (5), 120 (2020).
- Wu, X., Chen, J., Wu, M., Zhao, J. X. Aptamers: active targeting ligands for cancer diagnosis and therapy. Theranostics. 5 (4), 322 (2015).
- Feng, X., et al. The aptamer functionalized nanocomposite used for prostate cancer diagnosis and therapy. Journal of Nanomaterials. 2022, (2022).
- Huang, J., et al. Advances in aptamer-based biomarker discovery. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 571 (2021).
- Ashrafuzzaman, M. Aptamers as both drugs and drug-carriers. BioMed Research International. 2014, (2014).
- Nakhjavani, M., Samarasinghe, R. M., Shigdar, S. Triple-negative breast cancer brain metastasis: an update on druggable targets, current clinical trials, and future treatment options. Drug Discovery Today. , (2022).
- Macdonald, J., et al. Development of a bifunctional aptamer targeting the transferrin receptor and epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) for the treatment of brain cancer metastases. ACS Chemical Neuroscience. 8 (4), 777-784 (2017).
- Macdonald, J., et al. Bifunctional aptamer-doxorubicin conjugate crosses the blood-brain barrier and selectively delivers its payload to EpCAM-positive tumor cells. Nucleic Acid Therapeutics. 30 (2), 117-128 (2020).
- Shigdar, S., Agnello, L., Fedele, M., Camorani, S., Cerchia, L. Profiling cancer cells by cell-SELEX: use of aptamers for discovery of actionable biomarkers and therapeutic applications thereof. Pharmaceutics. 14 (1), 28 (2021).
- Rahimizadeh, K., et al. Development of cell-specific aptamers: recent advances and insight into the selection procedures. Molecules. 22 (12), 2070 (2017).
- Chen, M., et al. Development of cell-SELEX technology and its application in cancer diagnosis and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 17 (12), 2079 (2016).
- Shigdar, S., et al. The use of sensitive chemical antibodies for diagnosis: detection of low levels of EpCAM in breast cancer. PLoS One. 8 (2), 57613 (2013).
- Ni, J., et al. Role of the EpCAM (CD326) in prostate cancer metastasis and progression. Cancer and Metastasis Reviews. 31 (3), 779-791 (2012).
- Ni, J., et al. Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) is associated with prostate cancer metastasis and chemo/radioresistance via the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (12), 2736-2748 (2013).
- McKeague, M., Kruse, P. F., Patterson, M. K., et al. . Tissue Culture. , 395-397 (1973).
- McKeague, M., et al. The minimum aptamer publication standards (MAPS guidelines) for de novo aptamer selection. Aptamers. 6, 10-18 (2022).
- Schoofs, G., Van Hout, A., D’huys, T., Schols, D., Van Loy, T. A flow cytometry-based assay to identify compounds that disrupt binding of fluorescently-labeled CXC Chemokine ligand 12 to CXC Chemokine receptor 4. Journal of Visualized Experiments. (133), e57271 (2018).
- McKinnon, K. M. Flow cytometry: an overview. Current Protocols in Immunology. 120 (1), 1-11 (2018).
- Kamiloglu, S., Sari, G., Ozdal, T., Capanoglu, E. Guidelines for cell viability assays. Food Frontiers. 1 (3), 332-349 (2020).
- Ruscito, A., DeRosa, M. C. Small-molecule binding aptamers: Selection strategies, characterization, and applications. Frontiers in Chemistry. 4, 14 (2016).
- McKeague, M., et al. Comprehensive analytical comparison of strategies used for small molecule aptamer evaluation. Analytical Chemistry. 87 (17), 8608-8612 (2015).
- Henri, J., Bayat, N., Macdonald, J., Shigdar, S. A guide to using nucleic acid aptamers in cell based assays. Aptamers. 23, (2019).
- Mao, H., et al. The mechanism and regularity of quenching the effect of bases on fluorophores: the base-quenched probe method. Analyst. 143 (14), 3292-3301 (2018).
- McKeague, M., et al. Analysis of in vitro aptamer selection parameters. Journal of Molecular Evolution. 81 (5), 150-161 (2015).
- Chen, B., et al. Targeting negative surface charges of cancer cells by multifunctional nanoprobes. Theranostics. 6 (11), 1887 (2016).
- Shigdar, S., et al. RNA aptamers targeting cancer stem cell marker CD133. Cancer Letters. 330 (1), 84-95 (2013).
- Amraee, M., Oloomi, M., Yavari, A., Bouzari, S. DNA aptamer identification and characterization for E. coli O157 detection using cell based SELEX method. Analytical Biochemistry. 536, 36-44 (2017).
- Yu, X. -. X., et al. Selection and characterization of a novel DNA aptamer, Apt-07S specific to hepatocellular carcinoma cells. Drug Design, Development and Therapy. 14, 1535 (2020).
