一种基于流式细胞术的细胞表面蛋白结合测定，用于评估抗癌适配体的选择性和特异性
Summary
抗癌适配体开发的必要步骤是测试其与靶标的结合。我们展示了一种基于流式细胞术的测定来研究这种结合，强调了包括阴性对照适配体和对该特定蛋白质呈阳性或阴性的癌细胞的重要性。
Abstract
开发抗癌适配体的一个关键挑战是有效地确定开发的适配体对目标蛋白的选择性和特异性。由于其与单克隆抗体相比的几个优点，适配体的开发在癌症研究人员中获得了极大的欢迎。通过指数富集（SELEX）对配体进行系统进化是开发目标蛋白质特异性适配体的最常见方法。在SELEX之后，快速有效的结合测定加快了鉴定过程，确认了适配体的选择性和特异性。
本文解释了一种基于流式细胞术的上皮细胞粘附分子特异性适配体（EpCAM）的分步流式细胞术结合测定。跨膜糖蛋白EpCAM在大多数癌中过表达，并在癌症的发生、进展和转移中发挥作用。因此，它是靶向药物递送到肿瘤的有价值的候选者。为了评估适配体对膜结合EpCAM的选择性和特异性，需要EpCAM阳性和阴性细胞。此外，还需要具有与EpCAM结合适配体相似的长度和二维（2D）结构的非结合性EpCAM适配体。结合测定包括不同的缓冲液（封闭缓冲液、洗涤缓冲液、孵育缓冲液和FACS缓冲液）和孵育步骤。
核酸适配体与细胞系一起孵育。在孵育和洗涤步骤之后，将使用灵敏的流式细胞术测定法评估细胞。结果分析显示EpCAM特异性适配体与EpCAM阳性细胞结合，而不是EpCAM阴性细胞。在EpCAM阳性细胞中，与非结合适配体对照相比，这被描述为EpCAM适配体向右结合的带移。在EpCAM阴性细胞中，EpCAM结合和非结合适配体的相应条带重叠。这证明了EpCAM适配体的选择性和特异性。虽然该协议侧重于EpCAM适配体，但该协议适用于其他已发布的适配体。
Introduction
癌症仍然是全球死亡的主要原因之一1。尽管近几十年来癌症治疗有了显着改善，但抗癌药物的开发仍然是一个备受争议的话题。这是因为化疗作为癌症治疗的支柱，伴随着严重的副作用，限制了患者对治疗的依从性。此外，化疗引起的癌症对治疗的耐药性限制了其作为医疗干预的唯一选择的应用。单克隆抗体（mAb）的应用增强了对癌症治疗的反应2。使用mAb的基本原理是提高化疗药物的疗效并尽量减少其不良反应。然而，单克隆抗体的管理也成为一项挑战。这不仅是因为mAb诱导的免疫反应，还因为动物依赖性和昂贵的生产成本以及困难的储存条件3。1990年代4 中核酸适配体的引入为癌症治疗带来了新的希望，因为核酸适配体的应用可以解决与mAb相关的挑战。
核酸适配体是专门为特定靶标产生的短核酸序列。通过指数富集（SELEX）系统进化配体是适配体生产的常用方法。在SELEX中，目标蛋白与随机核苷酸序列文库一起孵育，并通过一系列迭代循环，纯化该蛋白特异性适配体。核酸适配子与mAb具有相似的靶标选择性和特异性，因此该领域的药物开发显示出广阔的未来应用前景。癌症生物标志物特异性适配体可用作单一药物和癌症诊断工具5，6，7。由于其纳米尺寸的结构，这些适配体还可以作为药物载体，将细胞毒性剂特异性地输送到肿瘤8。这将提高靶向药物递送的疗效，并减少化疗相关的脱靶不良反应。此外，这些纳米药物具有高组织渗透率，这使它们成为深部肿瘤药物递送和治疗的理想候选者。核酸适配体还可以设计成靶向在血脑屏障（BBB）上表达的转运蛋白，以改善药物向脑肿瘤的输送9。这种适配体的一个很好的例子是双功能适配体，靶向转铁蛋白受体（TfR）10以增强跨BBB的药物递送，并将细胞毒性药物有效载荷递送到肿瘤细胞11。
尽管核酸适配体具有所有优点，但该领域的药物开发尚未产生上市的、成功的抗癌药物。其中一个原因可能是缺乏该领域研究人员可以在全球范围内遵循的标准和可重复的方法。在本文中，展示了适配体与细胞表面表达的天然蛋白质结合的分步方案。该方案是抗癌适配体临床前评估的先决条件步骤。进行该测定以显示从SELEX或已发布的适配体序列中收集的纯化适配体的选择性和特异性，以确认选择性和特异性。这种基于流式细胞术的测定是一种快速、可靠、灵敏的测定，可准确显示适配体的选择性和特异性，其中核酸适配体正在针对细胞表面的蛋白质进行测试12，13，14。该方法使用本文15所示的EpCAM特异性适配体的结合进行了演示。EpCAM作为一种跨膜糖蛋白，在肿瘤细胞信号传导、进展、迁移和转移中发挥作用16，17。为了显示该适配体的选择性和特异性，使用了EpCAM阳性和阴性癌细胞。先前开发的EpCAM特异性适配体TEPP（5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′）和阴性对照适体TENN（5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3）分别用作EpCAM结合和非结合适配体10。TEPP和TENN的3’端都用TYE665荧光团标记。
TEPP是一种双功能适配体，一端靶向EpCAM，另一端靶向TfR。这使得TEPP成为EpCAM+ 脑肿瘤药物递送的合适候选者。使用其TfR特异性末端，TEPP穿过血脑屏障，并使用EpCAM特异性末端找到肿瘤并将其货物（例如，细胞毒性药物）输送到肿瘤。TENN具有与TEPP相似的长度和2D结构，但它对EpCAM或TfR没有亲和力，因此是一种合适的阴性对照适配体。本文使用TEPP和TENN，使用流式细胞术测试适配体与靶蛋白的结合。该协议适用于细胞特异性适配体的开发。它也适用于文献中可用的适配体序列的进一步补充和确认分析。该协议也可以由那些刚进入适配体领域的人使用，他们正在考虑将以前发表的适配体用于他们的研发（R&D）目的。本文研究了文献中可用的两种适配体序列。
Protocol
Representative Results
Discussion
开发新适配体的主要挑战是缺乏适用于该过程不同步骤的标准指南。McKeague等人最近证明了一些相关的挑战，这些挑战导致出版物中数据的呈现不明确，并且无法复制该研究。他们提出了表征适配体所必需的基本准则19。核酸适配体结合测定是筛选和/或表征核酸适配体23的关键步骤，该试剂被该领域的研究人员广泛使用。由于没有单一的指南来显示分步方案，因…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢心理和身体健康与临床翻译研究所 （IMPACT） SEED 资金、迪肯大学的“阿尔弗雷德·迪肯博士后研究奖学金”计划和“澳大利亚政府研究培训计划奖学金”。
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes with attached lid | Sigma-Aldrich | T6649 | |
| 15 mL CellStar blue screw cap, conical bottom tube | Greiner Bio One | 188271 | |
| 5 mL serological pipettes | Greiner Bio One | 606180 | |
| BD FACSCanto II Flow Becton Dickinson Cytometer | Becton Dickinson | N/A | |
| BD FACSDiva V9.0 | BD Biosciences | N/A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Lyophilized powder | Sigma-AldrichTM | A7906-50G | |
| Bright-line Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose Media Powder | Life Technologies | 12100046 | |
| Dulbecco’s Phosphate- Buffered Saline (DPBS) | Life Technologies | 21300025 | |
| FlowJo, LLC 10.8.1 | BD Biosciences | N/A | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
| HEK293T | American Type Culture Collection | ACS-4500 | |
| Heracell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Heraeus Megafuge 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
| Microplate, PS, 96 well, F-bottom (Chimney well), Black | Greiner Bio One | 655076 | |
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) tablets | Life Technologies | 18912014 | |
| Pyrogen- and RNase-free ultrapure water | Milli-Q | ||
| T75 Cell Culture flask | Cellstar | 658170 | |
| TENN | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3 |
| TEPP | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′ |
| Transfer RNA (tRNA) | Sigma-Aldrich | R8508-5X1ML | |
| Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 |
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