Et flowcytometribaseret celleoverfladeproteinbindende assay til vurdering af selektivitet og specificitet af en anticancer aptamer

Summary

Et nødvendigt skridt i udvikling af anticancer aptamer er at teste dets binding til målet. Vi demonstrerer et flowcytometrisk baseret assay for at studere denne binding og understreger vigtigheden af at inkludere en negativ kontrolaptamer og kræftceller, der er positive eller negative for det pågældende protein.

Abstract

En vigtig udfordring ved udvikling af en anticancer aptamer er effektivt at bestemme selektiviteten og specificiteten af den udviklede aptamer til målproteinet. På grund af sine mange fordele i forhold til monoklonale antistoffer har aptamerudvikling vundet enorm popularitet blandt kræftforskere. Systematisk udvikling af ligander ved eksponentiel berigelse (SELEX) er den mest almindelige metode til udvikling af aptamere, der er specifikke for proteiner af interesse. Efter SELEX fremskynder et hurtigt og effektivt bindende assay identifikationsprocessen, hvilket bekræfter aptamerens selektivitet og specificitet.

Dette papir forklarer et trin-for-trin flow cytometrisk baseret bindingsassay af en aptamer, der er specifik for epitelcellulært adhæsionsmolekyle (EpCAM). Transmembranglykoproteinet EpCAM er overudtrykt i de fleste karcinomer og spiller roller i kræftinitiering, progression og metastase. Derfor er det en værdifuld kandidat til målrettet lægemiddellevering til tumorer. For at evaluere selektiviteten og specificiteten af aptameren til det membranbundne EpCAM kræves EpCAM-positive og -negative celler. Derudover kræves en ikke-bindende EpCAM-aptamer med en lignende længde og 2-dimensionel (2D) struktur som EpCAM-bindende aptamer. Bindingsanalysen omfatter forskellige buffere (blokeringsbuffer, vaskebuffer, inkubationsbuffer og FACS-buffer) og inkubationstrin.

Aptameren inkuberes med cellelinjerne. Efter inkubations- og vasketrinnene evalueres cellerne ved hjælp af et følsomt flowcytometriassay. Analyse af resultaterne viser bindingen af den EpCAM-specifikke aptamer til EpCAM-positive celler og ikke de EpCAM-negative celler. I EpCAM-positive celler er dette afbildet som et båndskift i bindingen af EpCAM-aptameren til højre sammenlignet med den ikke-bindende aptamerkontrol. I EpCAM-negative celler overlapper de tilsvarende bånd af EpCAM-bindende og -ikke-bindende aptamerer. Dette viser selektiviteten og specificiteten af EpCAM-aptameren. Mens denne protokol er fokuseret på EpCAM-aptameren, gælder protokollen for andre offentliggjorte aptamere.

Introduction

Kræft er stadig en af de hyppigste årsager til dødelighed^{på verdensplan 1}. På trods af den betydelige forbedring i kræftbehandling i de seneste årtier er udvikling af kræftmedicin stadig et meget debatteret emne. Dette skyldes, at kemoterapi, som grundpillen i kræftbehandling, ledsages af alvorlige bivirkninger, der begrænser patientens overholdelse af behandlingen. Desuden har kemoterapi-induceret kræftresistens over for behandling begrænset dets anvendelse som det eneste valg af medicinsk intervention. Anvendelsen af monoklonale antistoffer (mAbs) introducerede et forbedret respons på^{kræftbehandlinger 2}. Begrundelsen for at bruge mAbs var at forbedre effekten af kemoterapeutika og minimere deres bivirkninger. Administrationen af mAbs blev dog også en udfordring. Dette skyldtes ikke kun de mAb-inducerede immunologiske reaktioner, men også de dyreafhængige og dyre produktionsomkostninger og vanskelige opbevaringsforhold³. Introduktion af aptamere i 1990’erne⁴ skabte nye forhåbninger inden for kræftbehandling, da anvendelsen af aptamere kunne løse de udfordringer, der er forbundet med mAbs.

Aptamerer er korte nukleinsyresekvenser, der specifikt produceres til et bestemt mål. Systematisk udvikling af ligander ved eksponentiel berigelse (SELEX) er en almindelig metode i aptamerproduktion. I SELEX inkuberes proteinet af interesse med et bibliotek af tilfældige nukleotidsekvenser, og gennem en række iterative cyklusser renses aptameren, der er specifik for dette protein. Aptamere har lignende målselektivitet og specificitet som mAbs, og derfor viser lægemiddeludvikling på dette område lovende fremtidige anvendelser. Aptamers specifikke for kræft biomarkører kunne anvendes som enkeltmedicin og kræftdiagnostiske værktøjer ^5,6,7. På grund af deres nano-størrelse struktur, disse aptamers kunne også fungere som lægemiddelbærere til at levere cytotoksiske midler specifikt til tumoren⁸. Dette ville øge effekten af målrettet lægemiddellevering og mindske kemoterapi-associerede, off-target bivirkninger. Desuden har disse nanolægemidler en høj vævsindtrængning, hvilket gør dem til en ønskelig kandidat til levering og behandling af dyb tumormedicin. Aptamere kan også designes til at målrette mod transportørerne udtrykt på blod-hjerne-barrieren (BBB) for at forbedre lægemiddelafgivelsen til hjernetumorer⁹. Et godt eksempel på en sådan aptamer er bifunktionelle aptamere, der er målrettet mod transferrinreceptoren (TfR)¹⁰ for at forbedre lægemiddelafgivelsen på tværs af BBB og levere en cytotoksisk lægemiddelnyttelast til tumorceller¹¹.

På trods af alle fordelene ved aptamerer har lægemiddeludvikling på dette område endnu ikke givet et markedsført, vellykket kræftlægemiddel. En af grundene til dette kunne være manglen på standard og reproducerbare metoder, der kunne følges globalt af forskere på området. I dette papir demonstreres en trin-for-trin protokol for en aptamerbinding til et naturligt protein udtrykt på celleoverfladen. Denne protokol er et forudsætningstrin i den prækliniske vurdering af anticancer-aptammere. Analysen udføres for at vise selektiviteten og specificiteten af den oprensede aptamer indsamlet fra SELEX eller en offentliggjort aptamersekvens til bekræftelse af selektivitet og specificitet. Dette flowcytometriske assay er et hurtigt, pålideligt, følsomt assay, der nøjagtigt viser aptamerens selektivitet og specificitet, hvor aptameren testes mod proteiner på celleoverfladen^12,13,14. Denne metode demonstreres ved hjælp af bindingen af en aptamer, der er specifik for EpCAM, vist i dette papir¹⁵. EpCAM, som et transmembranglykoprotein, spiller roller i tumorcellesignalering, progression, migration og metastase^16,17. For at vise selektiviteten og specificiteten af denne aptamer blev EpCAM-positive og -negative kræftceller anvendt. Den tidligere udviklede EpCAM-specifikke aptamer, TEPP (5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′) og en negativ kontrolaptamer, TENN (5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3), blev brugt som henholdsvis EpCAM-bindende og -ikke-bindende aptamere¹⁰. 3′-enden af både TEPP og TENN blev mærket med en TYE665 fluorophore.

TEPP er en bifunktionel aptamer, der er målrettet mod EpCAM fra den ene ende og TfR i den anden. Dette har gjort TEPP til en passende kandidat til lægemiddellevering til EpCAM⁺ hjernetumorer. Ved hjælp af sin TfR-specifikke ende krydser TEPP blod-hjerne-barrieren og ved hjælp af den EpCAM-specifikke ende finder tumoren og leverer sin last (f.eks. Cytotoksiske lægemidler) til tumoren. TENN har en lignende længde og 2D-struktur som TEPP, men den har ikke affinitet for EpCAM eller TfR og er derfor en passende negativ kontrolaptamer. Ved hjælp af TEPP og TENN er test af bindingen af en aptamer til målproteinet ved hjælp af flowcytometri vist i dette papir. Denne protokol gælder for udviklingen af cellespecifikke aptamerer. Det gælder også for yderligere supplerende og bekræftende analyser af de aptamersekvenser, der er tilgængelige i litteraturen. Protokollen kan også bruges af dem, der er nye inden for aptamerfeltet, der ser på at bruge en tidligere offentliggjort aptamer til deres forsknings- og udviklingsformål (F &U). I dette papir studeres to aptamersekvenser, der er tilgængelige i litteraturen.

Protocol

BEMÆRK: Før eksperimentet påbegyndes, skal du bære personlige værnemidler, herunder en laboratoriefrakke, handsker og beskyttelsesbriller. Se materialetabellen for detaljer om materialer, reagenser, udstyr og software, der bruges i denne protokol. 1. Buffere, der kræves til analysen Forbered de buffere, der kræves til dette forsøg – SELEX-bufferen, der kræves til aptamerfoldning, blokeringsbuffer (BB), vaskebuffer (WB) og bindingsbuffer (BiB…

Representative Results

Et vigtigt aspekt af ny lægemiddelopdagelse og -udvikling er at sikre selektiviteten og specificiteten af lægemiddelkandidaten. Dette betyder, at lægemiddelkandidaten skal være i stand til at skelne mellem forskellige celler og kun påvirke cellepopulationen af interesse (selektivitet). Selektivitet studeres ved hjælp af cellelinjer, der adskiller sig med hensyn til ekspression af proteinet af interesse. I denne undersøgelse blev MDA-MB-231 og HEK 293T cellelinjer valgt som EpCAM-positive og -negative celler. Speci…

Discussion

Den største udfordring med at udvikle nye aptamers er manglen på standardretningslinjer, der gælder for forskellige trin i denne proces. McKeague et al. har for nylig demonstreret nogle af de tilknyttede udfordringer, som fører til uklare præsentationer af data i publikationer og manglende replikering af forskningen. De foreslog grundlæggende retningslinjer, der var nødvendige for overvejelse ved karakterisering af aptamers¹⁹. Et aptamer bindende assay er et kritisk skridt i screening og / …

Materials

1.5 mL microcentrifuge tubes with attached lid	Sigma-Aldrich	T6649
15 mL CellStar blue screw cap, conical bottom tube	Greiner Bio One	188271
5 mL serological pipettes	Greiner Bio One	606180
BD FACSCanto II Flow Becton Dickinson Cytometer	Becton Dickinson	N/A
BD FACSDiva V9.0	BD Biosciences	N/A
Bovine Serum Albumin (BSA), Lyophilized powder	Sigma-AldrichTM	A7906-50G
Bright-line Hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose Media Powder	Life Technologies	12100046
Dulbecco’s Phosphate- Buffered Saline (DPBS)	Life Technologies	21300025
FlowJo, LLC 10.8.1	BD Biosciences	N/A
Foetal Bovine Serum (FBS)	Bovogen	SFBS-F
HEK293T	American Type Culture Collection	ACS-4500
Heracell 150i CO2 Incubator	Thermo Fisher Scientific	N/A
Heraeus Megafuge 16R Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	N/A
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
MDA-MB-231	American Type Culture Collection	CRM-HTB-26
Microplate, PS, 96 well, F-bottom (Chimney well), Black	Greiner Bio One	655076
MiniAmp Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	A37834
Phosphate-Buffered Saline (PBS) tablets	Life Technologies	18912014
Pyrogen- and RNase-free ultrapure water	Milli-Q
T75 Cell Culture flask	Cellstar	658170
TENN	Integrated DNA Technologies	N/A	5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3
TEPP	Integrated DNA Technologies	N/A	5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′
Transfer RNA (tRNA)	Sigma-Aldrich	R8508-5X1ML
Trypan Blue Solution	Life Technologies	15250061
Trypsin-EDTA	Gibco	15400054