एंटीकैंसर एपटामर की चयनात्मकता और विशिष्टता का आकलन करने के लिए एक फ्लो साइटोमेट्री-आधारित सेल सरफेस प्रोटीन बाइंडिंग परख
Summary
एंटीकैंसर एपटामर विकास में एक आवश्यक कदम लक्ष्य के लिए इसके बंधन का परीक्षण करना है। हम इस बंधन का अध्ययन करने के लिए एक प्रवाह साइटोमेट्रिक-आधारित परख का प्रदर्शन करते हैं, एक नकारात्मक नियंत्रण एपटामर और कैंसर कोशिकाओं को शामिल करने के महत्व पर जोर देते हैं जो उस विशेष प्रोटीन के लिए सकारात्मक या नकारात्मक हैं।
Abstract
एंटीकैंसर एपटामर विकसित करने में एक महत्वपूर्ण चुनौती लक्ष्य प्रोटीन के लिए विकसित एपटामर की चयनात्मकता और विशिष्टता को कुशलतापूर्वक निर्धारित करना है। मोनोक्लोनल एंटीबॉडी पर इसके कई फायदों के कारण, एपटामर विकास ने कैंसर शोधकर्ताओं के बीच भारी लोकप्रियता हासिल की है। घातीय संवर्धन (एसईएलईएक्स) द्वारा लिगेंड का व्यवस्थित विकास रुचि के प्रोटीन के लिए विशिष्ट एपटामर विकसित करने का सबसे आम तरीका है। एसईएलईएक्स के बाद, एक त्वरित और कुशल बाध्यकारी परख पहचान की प्रक्रिया को तेज करती है, एपटामर की चयनात्मकता और विशिष्टता की पुष्टि करती है।
यह पेपर उपकला सेलुलर आसंजन अणु (ईपीकैम) के लिए विशिष्ट एपटामर के चरण-दर-चरण प्रवाह साइटोमेट्रिक-आधारित बाध्यकारी परख की व्याख्या करता है। ट्रांसमेम्ब्रेन ग्लाइकोप्रोटीन ईपीकैम अधिकांश कार्सिनोमा में अतिरंजित होता है और कैंसर दीक्षा, प्रगति और मेटास्टेसिस में भूमिका निभाता है। इसलिए, यह ट्यूमर को लक्षित दवा वितरण के लिए एक मूल्यवान उम्मीदवार है। झिल्ली-बाध्य ईपीकैम के लिए एपटामर की चयनात्मकता और विशिष्टता का मूल्यांकन करने के लिए, ईपीकैम-पॉजिटिव और -नकारात्मक कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, EpCAM-बाइंडिंग एपटामर के समान लंबाई और 2-आयामी (2D) संरचना के साथ एक गैर-बाध्यकारी EpCAM एपटामर की आवश्यकता होती है। बाध्यकारी परख में विभिन्न बफर (ब्लॉकिंग बफर, वॉश बफर, इनक्यूबेशन बफर और एफएसीएस बफर) और इनक्यूबेशन चरण शामिल हैं।
एपटामर को सेल लाइनों के साथ इनक्यूबेट किया जाता है। इनक्यूबेशन और धोने के चरणों के बाद, कोशिकाओं का मूल्यांकन एक संवेदनशील प्रवाह साइटोमेट्री परख का उपयोग करके किया जाएगा। परिणामों का विश्लेषण ईपीकैम-विशिष्ट एपटामर को ईपीकैम-पॉजिटिव कोशिकाओं से जोड़ता है, न कि ईपीकैम-नकारात्मक कोशिकाओं को। ईपीकैम-पॉजिटिव कोशिकाओं में, इसे गैर-बाध्यकारी एपटामर नियंत्रण की तुलना में दाईं ओर ईपीकैम एपटामर के बंधन में एक बैंड शिफ्ट के रूप में दर्शाया गया है। ईपीकैम-नकारात्मक कोशिकाओं में, ईपीकैम-बाइंडिंग और -नॉन-बाइंडिंग एपटामर के संबंधित बैंड ओवरलैप होते हैं। यह एपकैम एपटामर की चयनात्मकता और विशिष्टता को प्रदर्शित करता है। जबकि यह प्रोटोकॉल ईपीकैम एपटामर पर केंद्रित है, प्रोटोकॉल अन्य प्रकाशित एपटामर पर लागू होता है।
Introduction
कैंसर अभीभी दुनिया भर में मृत्यु दर के प्रमुख कारणों में से एक है। हाल के दशकों में कैंसर के उपचार में महत्वपूर्ण सुधार के बावजूद, एंटीकैंसर दवा विकास अभी भी एक अत्यधिक बहस का विषय है। ऐसा इसलिए है क्योंकि कीमोथेरेपी, कैंसर के उपचार के मुख्य आधार के रूप में, गंभीर दुष्प्रभावों के साथ होती है जो उपचार के साथ रोगी के अनुपालन को सीमित करती है। इसके अलावा, उपचार के लिए कीमोथेरेपी-प्रेरित कैंसर प्रतिरोध ने चिकित्सा हस्तक्षेप के एकमात्र विकल्प के रूप में इसके आवेदन को प्रतिबंधित कर दिया है। मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबीएस) के आवेदन ने कैंसर उपचार के लिए एक बढ़ी हुई प्रतिक्रिया पेशकी। एमएबीएस का उपयोग करने का तर्क कीमोथेरेपी की प्रभावकारिता में सुधार करना और उनकी प्रतिकूल प्रतिक्रियाओं को कम करना था। हालांकि, एमएबीएस का प्रशासन भी एक चुनौती बन गया। यह न केवल एमएबी-प्रेरित इम्यूनोलॉजिकल प्रतिक्रियाओं के कारण था, बल्कि पशु-निर्भर और महंगी उत्पादन लागत और कठिन भंडारण स्थितियोंके कारण भी था। 1990 के दशक में एप्टामर की शुरूआतने कैंसर के उपचार में नई उम्मीदें जगाईं, क्योंकि एप्टामर का आवेदन एमएबीएस से जुड़ी चुनौतियों का समाधान कर सकता है।
एपटामर छोटे न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम हैं जो विशेष रूप से एक निश्चित लक्ष्य के लिए उत्पादित होते हैं। घातीय संवर्धन (एसईएलईएक्स) द्वारा लिगेंड का व्यवस्थित विकास एपटामर उत्पादन में एक सामान्य विधि है। एसईएलईएक्स में, रुचि के प्रोटीन को यादृच्छिक न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमों की एक लाइब्रेरी के साथ इनक्यूबेट किया जाता है, और पुनरावृत्ति चक्रों की एक श्रृंखला के माध्यम से, उस प्रोटीन के लिए विशिष्ट एपटामर को शुद्ध किया जाता है। एपटामर में एमएबीएस के समान लक्ष्य चयनात्मकता और विशिष्टता है, और इसलिए इस क्षेत्र में दवा विकास आशाजनक भविष्य के अनुप्रयोगों को दर्शाता है। कैंसर बायोमार्कर के लिए विशिष्ट एपटामर को एकल दवाओं और कैंसर नैदानिक उपकरण 5,6,7 के रूप में लागू किया जा सकता है। उनकी नैनो-आकार की संरचना के कारण, ये एपटामर विशेष रूप से ट्यूमर8 में साइटोटोक्सिक एजेंटों को वितरित करने के लिए दवा वाहक के रूप में भी कार्य कर सकते हैं। यह लक्षित दवा वितरण की प्रभावकारिता को बढ़ाएगा और कीमोथेरेपी से जुड़े, ऑफ-टारगेट प्रतिकूल प्रतिक्रियाओं को कम करेगा। इसके अलावा, इन नैनोमेडिसिन में एक उच्च ऊतक प्रवेश होता है, जो उन्हें गहरे ट्यूमर दवा वितरण और उपचार के लिए एक वांछनीय उम्मीदवार बनाता है। एपटामर को मस्तिष्क ट्यूमर 9 में दवा वितरण में सुधार के लिए रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) पर व्यक्त ट्रांसपोर्टरों को लक्षित करने के लिए भी डिज़ाइन किया जा सकताहै। इस तरह के एपटामर का एक अच्छा उदाहरण द्विक्रियाशील एपटामर हैं, जो बीबीबी में दवा वितरण को बढ़ाने के लिए ट्रांसफरिन रिसेप्टर (टीएफआर) 10 को लक्षित करते हैं, और ट्यूमर कोशिकाओं11 में साइटोटोक्सिक दवा पेलोड वितरित करते हैं।
एपटामर के सभी फायदों के बावजूद, इस क्षेत्र में दवा के विकास ने अभी तक एक विपणन, सफल एंटीकैंसर दवा का उत्पादन नहीं किया है। इसका एक कारण मानक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीकों की कमी हो सकती है जो क्षेत्र में शोधकर्ताओं द्वारा विश्व स्तर पर पालन की जा सकती है। इस पेपर में, सेल की सतह पर व्यक्त एक देशी प्रोटीन के लिए एपटामर बाइंडिंग का एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदर्शित किया गया है। यह प्रोटोकॉल एंटीकैंसर एपटामर के प्रीक्लिनिकल मूल्यांकन में एक आवश्यक कदम है। परख चयनात्मकता और विशिष्टता की पुष्टि के लिए एसईएलईएक्स या प्रकाशित एपटामर अनुक्रम से एकत्र किए गए शुद्ध एपटामर की चयनात्मकता और विशिष्टता दिखाने के लिए किया जाता है। यह प्रवाह साइटोमेट्रिक-आधारित परख एक तेज, विश्वसनीय, संवेदनशील परख है जो एपटामर की चयनात्मकता और विशिष्टता को सटीक रूप से दिखाती है, जहां एपटामर को सेल की सतह 12,13,14 पर प्रोटीनके खिलाफ परीक्षण किया जा रहा है। इस विधि को इस पेपर15 में दिखाए गए ईपीकैम के लिए विशिष्ट एपटामर के बंधन का उपयोग करके प्रदर्शित किया गया है। ईपीकैम, एक ट्रांसमेम्ब्रेन ग्लाइकोप्रोटीन के रूप में, ट्यूमर सेल सिग्नलिंग, प्रगति, प्रवासन और मेटास्टेसिस16,17 में भूमिका निभाता है। इस एपटामर की चयनात्मकता और विशिष्टता दिखाने के लिए, ईपीकैम-पॉजिटिव और -नकारात्मक कैंसर कोशिकाओं का उपयोग किया गया था। पहले से विकसित ईपीकैम विशिष्ट एपटामर, टीईपीपी (5′-जीसी जीसीजी जीटीएसी जीसी जीसी टीए एसीजी जीए जीजीटीटीजीसीजी टीसीसी जीटी -3′), और एक नकारात्मक नियंत्रण एपटामर, टीईएनएन (5′-जीसी जीसीजी टीजीसीए सीजीसी जीसी टीए एसीजी जीए टीटीसीटीटीटीटी टीसीसी जीटी -3), क्रमशः ईपीकैम-बाइंडिंग और -नॉन-बाइंडिंग एपटामरके रूप में उपयोग किया गया था। टीईपीपी और टीईएनएन दोनों के 3 ‘छोर को टीवाईई 665 फ्लोरोफोरे के साथ लेबल किया गया था।
टीईपीपी एक द्विक्रियाशील एपटामर है जो एक छोर से ईपीकैम और दूसरे पर टीएफआर को लक्षित करता है। इसने टीईपीपी को ईपीकैम + मस्तिष्क ट्यूमर के लिए दवा वितरण के लिए एक उपयुक्त उम्मीदवार बना दिया है। अपने टीएफआर-विशिष्ट अंत का उपयोग करते हुए, टीईपी रक्त-मस्तिष्क बाधा को पार करता है, और ईपीकैम-विशिष्ट अंत का उपयोग करके, ट्यूमर का पता लगाता है और ट्यूमर को अपना कार्गो (जैसे, साइटोटोक्सिक ड्रग्स) पहुंचाता है। टीईएनएन की टीईपीपी के समान लंबाई और 2 डी संरचना है, लेकिन इसमें ईपीसीएएम या टीएफआर के लिए संबंध नहीं है, और इसलिए यह एक उपयुक्त नकारात्मक नियंत्रण एपटामर है। टीईपीपी और टीईएनएन का उपयोग करते हुए, फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके लक्ष्य प्रोटीन के लिए एक एपटामर के बंधन का परीक्षण इस पेपर में दिखाया गया है। यह प्रोटोकॉल सेल-विशिष्ट एपटामर के विकास पर लागू होता है। यह साहित्य में उपलब्ध एपटामर अनुक्रमों के आगे पूरक और पुष्टिकरण विश्लेषण पर भी लागू होता है। प्रोटोकॉल का उपयोग एपटामर क्षेत्र में नए लोगों द्वारा भी किया जा सकता है जो अपने अनुसंधान और विकास (आर एंड डी) उद्देश्यों के लिए पहले प्रकाशित एपटामर का उपयोग करना चाहते हैं। इस पेपर में, साहित्य में उपलब्ध दो एपटामर अनुक्रमों का अध्ययन किया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
नए एपटामर विकसित करने के साथ महत्वपूर्ण चुनौती मानक दिशानिर्देशों की कमी है जो इस प्रक्रिया के विभिन्न चरणों पर लागू होती है। मैककेग एट अल ने हाल ही में कुछ संबंधित चुनौतियों का प्रदर्शन किया है, जो प्?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक मानसिक और शारीरिक स्वास्थ्य और नैदानिक अनुवाद संस्थान (इम्पैक्ट) सीड फंडिंग, डीकिन विश्वविद्यालय में “अल्फ्रेड डीकिन पोस्टडॉक्टरल रिसर्च फैलोशिप” कार्यक्रम और “ऑस्ट्रेलियाई सरकार अनुसंधान प्रशिक्षण कार्यक्रम छात्रवृत्ति” को स्वीकार करते हैं।
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes with attached lid | Sigma-Aldrich | T6649 | |
| 15 mL CellStar blue screw cap, conical bottom tube | Greiner Bio One | 188271 | |
| 5 mL serological pipettes | Greiner Bio One | 606180 | |
| BD FACSCanto II Flow Becton Dickinson Cytometer | Becton Dickinson | N/A | |
| BD FACSDiva V9.0 | BD Biosciences | N/A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Lyophilized powder | Sigma-AldrichTM | A7906-50G | |
| Bright-line Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose Media Powder | Life Technologies | 12100046 | |
| Dulbecco’s Phosphate- Buffered Saline (DPBS) | Life Technologies | 21300025 | |
| FlowJo, LLC 10.8.1 | BD Biosciences | N/A | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
| HEK293T | American Type Culture Collection | ACS-4500 | |
| Heracell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Heraeus Megafuge 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
| Microplate, PS, 96 well, F-bottom (Chimney well), Black | Greiner Bio One | 655076 | |
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) tablets | Life Technologies | 18912014 | |
| Pyrogen- and RNase-free ultrapure water | Milli-Q | ||
| T75 Cell Culture flask | Cellstar | 658170 | |
| TENN | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3 |
| TEPP | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′ |
| Transfer RNA (tRNA) | Sigma-Aldrich | R8508-5X1ML | |
| Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 |
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