抗がんアプタマーの選択性と特異性を評価するためのフローサイトメトリーベースの細胞表面タンパク質結合アッセイ
Summary
抗がんアプタマー開発に必要なステップは、標的への結合をテストすることです。この結合を研究するためのフローサイトメトリーベースのアッセイを実証し、ネガティブコントロールのアプタマーとその特定のタンパク質に対して陽性または陰性の癌細胞を含めることの重要性を強調しています。
Abstract
抗がんアプタマーの開発における重要な課題は、開発したアプタマーの標的タンパク質に対する選択性と特異性を効率的に決定することです。モノクローナル抗体に比べていくつかの利点があるため、アプタマーの開発は癌研究者の間で絶大な人気を得ています。指数関数的濃縮(SELEX)によるリガンドの系統的進化は、目的のタンパク質に特異的なアプタマーを開発する最も一般的な方法です。SELEXに続いて、迅速かつ効率的な結合アッセイにより同定プロセスが加速され、アプタマーの選択性と特異性が確認されます。
この論文では、上皮細胞接着分子(EpCAM)に特異的なアプタマーの段階的なフローサイトメトリーベースの結合アッセイについて説明します。膜貫通糖タンパク質EpCAMは、ほとんどの癌腫で過剰発現しており、癌の開始、進行、および転移に役割を果たしています。したがって、腫瘍への標的薬物送達の貴重な候補です。膜結合型EpCAMに対するアプタマーの選択性および特異性を評価するには、EpCAM陽性および陰性細胞が必要である。さらに、EpCAM結合アプタマーと同様の長さおよび2次元(2D)構造を有する非結合EpCAMアプタマーが必要である。結合アッセイには、異なるバッファー(ブロッキングバッファー、洗浄バッファー、インキュベーションバッファー、およびFACSバッファー)およびインキュベーションステップが含まれます。
アプタマーは細胞株と共にインキュベートされる。インキュベーションおよび洗浄ステップに続いて、細胞は高感度フローサイトメトリーアッセイを使用して評価されます。結果の分析は、EpCAM特異的アプタマーのEpCAM陰性細胞ではなくEpCAM陽性細胞への結合を示す。EpCAM陽性細胞では、これは、非結合アプタマー対照と比較して、EpCAMアプタマーの右への結合におけるバンドシフトとして描かれる。EpCAM陰性細胞では、EpCAM結合アプタマーおよび非結合アプタマーの対応するバンドが重複する。これは、EpCAMアプタマーの選択性と特異性を示しています。このプロトコルはEpCAMアプタマーに焦点を当てていますが、このプロトコルは他の公開されているアプタマーにも適用できます。
Introduction
がんは依然として世界中の主要な死亡原因の1つです1。ここ数十年で癌治療が大幅に改善されたにもかかわらず、抗癌剤の開発は依然として非常に議論されているトピックです。これは、がん治療の主力である化学療法には、患者の治療へのコンプライアンスを制限する重篤な副作用が伴うためです。さらに、化学療法誘発性癌治療に対する耐性は、医学的介入の唯一の選択肢としてのその適用を制限している。モノクローナル抗体(mAb)の適用により、がん治療に対する反応が増強されました2。モノクローナル抗体を使用する理論的根拠は、化学療法薬の有効性を改善し、その副作用を最小限に抑えることでした。.しかし、モノクローナル抗体の投与も課題となりました。これは、mAbによる免疫反応だけでなく、動物に依存して高価な製造コストと困難な保管条件によるものでした3。1990年代のアプタマーの導入4 は、アプタマーの適用がモノクローナル抗体に関連する課題に対処できるため、癌治療に新たな希望をもたらしました。
アプタマーは、特定の標的に対して特異的に産生される短い核酸配列です。指数関数的濃縮(SELEX)によるリガンドの系統的進化は、アプタマー生産における一般的な方法です。SELEXでは、目的のタンパク質をランダムなヌクレオチド配列のライブラリとともにインキュベートし、一連の反復サイクルを経て、そのタンパク質に特異的なアプタマーを精製します。アプタマーはモノクローナル抗体と同様の標的選択性・特異性を有しており、この分野の医薬品開発は有望な応用が期待されています。がんバイオマーカーに特異的なアプタマーは、単剤およびがん診断ツールとして適用できます5、6、7。ナノサイズの構造により、これらのアプタマーは、細胞傷害性物質を腫瘍に特異的に送達するための薬物キャリアとしても作用する可能性があります8。これにより、標的薬物送達の有効性が高まり、化学療法に関連するオフターゲットの副作用が減少します。.さらに、これらのナノ医薬品は組織浸透率が高いため、深部腫瘍の薬物送達および治療の望ましい候補となります。アプタマーは、血液脳関門(BBB)上に発現するトランスポーターを標的にして、脳腫瘍への薬物送達を改善するように設計することもできる9。このようなアプタマーの良い例は、トランスフェリン受容体(TfR)10 を標的にしてBBB全体の薬物送達を増強し、細胞傷害性薬物ペイロードを腫瘍細胞に送達する二機能性アプタマーである11。
アプタマーのすべての利点にもかかわらず、この分野での医薬品開発はまだ市販され、成功した抗がん剤を生み出していません。この理由の1つは、この分野の研究者が世界的に従うことができる標準的で再現可能な方法の欠如である可能性があります。この論文では、細胞表面に発現する天然タンパク質に結合するアプタマーの段階的なプロトコルが実証されています。このプロトコルは、抗がんアプタマーの前臨床評価における前提条件ステップです。アッセイは、選択性および特異性の確認のためにSELEXまたは公表されたアプタマー配列から収集された精製アプタマーの選択性および特異性を示すために行われる。このフローサイトメトリーベースのアッセイは、アプタマーの選択性と特異性を正確に示す迅速で信頼性の高い高感度アッセイであり、アプタマーは細胞表面のタンパク質に対してテストされています12、13、14。この方法は、この論文15に示すEpCAMに特異的なアプタマーの結合を用いて実証される。膜貫通糖タンパク質としてのEpCAMは、腫瘍細胞のシグナル伝達、進行、遊走、および転移において役割を果たします16,17。このアプタマーの選択性と特異性を示すために、EpCAM陽性および陰性の癌細胞を使用した。以前に開発されたEpCAM特異的アプタマーであるTEPP(5′-GC GCG GTAC CGC GC TAACG GA GGTTGCG TCC GT-3′)および陰性対照アプタマーであるTENN(5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3)を、それぞれEpCAM結合性アプタマーおよび非結合性アプタマーとして用いた10。TEPPおよびTENNの両方の3’末端をTYE665フルオロフォアで標識した。
TEPPは、一方の端からEpCAMを、もう一方の端からTfRを標的とする二機能性アプタマーです。これにより、TEPPはEpCAM+ 脳腫瘍への薬物送達に適した候補となっています。TEPPは、そのTfR特異的末端を使用して血液脳関門を横断し、EpCAM特異的末端を使用して腫瘍を発見し、その貨物(細胞傷害性薬物など)を腫瘍に送達する。TENNはTEPPと同様の長さと2D構造を持っていますが、EpCAMやTfRに親和性がないため、適切なネガティブコントロールアプタマーです。TEPPとTENNを用いて、フローサイトメトリーを用いてアプタマーの標的タンパク質への結合を試験する試験を本論文に示します。このプロトコルは、細胞特異的アプタマーの開発に適用されます。また、文献で入手可能なアプタマー配列のさらなる相補的および確認的解析にも適用可能である。このプロトコルは、以前に公開されたアプタマーを研究開発(R&D)目的で使用することを検討しているアプタマー分野の初心者にも使用できます。この論文では、文献で利用可能な2つのアプタマー配列を研究しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
新しいアプタマーを開発する際の重要な課題は、このプロセスのさまざまなステップに適用される標準的なガイドラインがないことです。McKeagueらは最近、関連する課題のいくつかを実証し、出版物でのデータの不明確な提示と研究の複製の失敗につながりました。彼らは、アプタマー19を特徴づける際に考慮するために必要な基本的なガイドラインを提案した。アプタマー…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、心身の健康と臨床翻訳研究所(IMPACT)SEEDの資金提供、ディーキン大学の「アルフレッドディーキンポスドク研究フェローシップ」プログラム、および「オーストラリア政府研究トレーニングプログラム奨学金」を認めています。
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes with attached lid | Sigma-Aldrich | T6649 | |
| 15 mL CellStar blue screw cap, conical bottom tube | Greiner Bio One | 188271 | |
| 5 mL serological pipettes | Greiner Bio One | 606180 | |
| BD FACSCanto II Flow Becton Dickinson Cytometer | Becton Dickinson | N/A | |
| BD FACSDiva V9.0 | BD Biosciences | N/A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Lyophilized powder | Sigma-AldrichTM | A7906-50G | |
| Bright-line Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose Media Powder | Life Technologies | 12100046 | |
| Dulbecco’s Phosphate- Buffered Saline (DPBS) | Life Technologies | 21300025 | |
| FlowJo, LLC 10.8.1 | BD Biosciences | N/A | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
| HEK293T | American Type Culture Collection | ACS-4500 | |
| Heracell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Heraeus Megafuge 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
| Microplate, PS, 96 well, F-bottom (Chimney well), Black | Greiner Bio One | 655076 | |
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) tablets | Life Technologies | 18912014 | |
| Pyrogen- and RNase-free ultrapure water | Milli-Q | ||
| T75 Cell Culture flask | Cellstar | 658170 | |
| TENN | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3 |
| TEPP | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′ |
| Transfer RNA (tRNA) | Sigma-Aldrich | R8508-5X1ML | |
| Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 |
Riferimenti
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