Un ensayo de unión a proteínas de superficie celular basado en citometría de flujo para evaluar la selectividad y la especificidad de un aptámero anticanceroso
Summary
Un paso necesario en el desarrollo de aptámeros anticancerosos es probar su unión al objetivo. Demostramos un ensayo basado en citometría de flujo para estudiar esta unión, enfatizando la importancia de incluir un aptámero de control negativo y células cancerosas que sean positivas o negativas para esa proteína en particular.
Abstract
Un desafío clave en el desarrollo de un aptámero anticanceroso es determinar eficientemente la selectividad y especificidad del aptámero desarrollado para la proteína diana. Debido a sus varias ventajas sobre los anticuerpos monoclonales, el desarrollo de aptámeros ha ganado una enorme popularidad entre los investigadores del cáncer. La evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX) es el método más común para desarrollar aptámeros específicos para proteínas de interés. Después de SELEX, un ensayo de unión rápido y eficiente acelera el proceso de identificación, confirmando la selectividad y especificidad del aptámero.
Este documento explica un ensayo de unión citométrico de flujo paso a paso de un aptámero específico para la molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM). La glicoproteína transmembrana EpCAM se sobreexpresa en la mayoría de los carcinomas y desempeña un papel en el inicio, la progresión y la metástasis del cáncer. Por lo tanto, es un candidato valioso para la administración de fármacos dirigidos a los tumores. Para evaluar la selectividad y especificidad del aptámero a la EpCAM unida a la membrana, se requieren células positivas y negativas para EpCAM. Además, se requiere un aptámero EpCAM no vinculante con una longitud y estructura bidimensional (2D) similares al aptámero de unión a EpCAM. El ensayo de unión incluye diferentes tampones (tampón de bloqueo, tampón de lavado, tampón de incubación y tampón FACS) y pasos de incubación.
El aptámero se incuba con las líneas celulares. Después de los pasos de incubación y lavado, las células se evaluarán mediante un ensayo de citometría de flujo sensible. El análisis de los resultados muestra la unión del aptámero específico de EpCAM a las células positivas para EpCAM y no a las células negativas para EpCAM. En las células positivas para EpCAM, esto se representa como un cambio de banda en la unión del aptámero EpCAM a la derecha en comparación con el control del aptámero no vinculante. En las células negativas para EpCAM, las bandas correspondientes de aptámeros de unión y no unión a EpCAM se superponen. Esto demuestra la selectividad y especificidad del aptámero EpCAM. Si bien este protocolo se centra en el aptámero EpCAM, el protocolo es aplicable a otros aptámeros publicados.
Introduction
El cáncer sigue siendo una de las principales causas de mortalidad en todo el mundo1. A pesar de la mejora significativa en el tratamiento del cáncer en las últimas décadas, el desarrollo de medicamentos contra el cáncer sigue siendo un tema muy debatido. Esto se debe a que la quimioterapia, como pilar del tratamiento del cáncer, se acompaña de efectos secundarios graves que limitan el cumplimiento del tratamiento por parte del paciente. Además, la resistencia al tratamiento del cáncer inducida por la quimioterapia ha restringido su aplicación como la única opción de intervención médica. La aplicación de anticuerpos monoclonales (mAbs) introdujo una respuesta mejorada a los tratamientos contra el cáncer2. La razón del uso de mAbs fue mejorar la eficacia de los quimioterapéuticos y minimizar sus reacciones adversas. Sin embargo, la administración de mAbs también se convirtió en un desafío. Esto no solo se debió a las reacciones inmunológicas inducidas por mAb, sino también a los costosos costos de producción dependientes de los animales y a las difíciles condiciones de almacenamiento3. La introducción de aptámeros en la década de 19904 generó nuevas esperanzas en el tratamiento del cáncer, ya que la aplicación de aptámeros podría abordar los desafíos asociados con los mAbs.
Los aptámeros son secuencias cortas de ácidos nucleicos que se producen específicamente para un determinado objetivo. La evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX) es un método común en la producción de aptámeros. En SELEX, la proteína de interés se incuba con una biblioteca de secuencias aleatorias de nucleótidos, y a través de una serie de ciclos iterativos, se purifica el aptámero específico para esa proteína. Los aptámeros tienen una selectividad y especificidad objetivo similares a los mAbs, y por lo tanto el desarrollo de fármacos en este campo muestra aplicaciones futuras prometedoras. Los aptámeros específicos para biomarcadores de cáncer podrían aplicarse como fármacos individuales y herramientas de diagnóstico del cáncer 5,6,7. Debido a su estructura de tamaño nanométrico, estos aptámeros también podrían actuar como portadores de fármacos para administrar agentes citotóxicos específicamente al tumor8. Esto aumentaría la eficacia de la administración dirigida de fármacos y disminuiría las reacciones adversas asociadas a la quimioterapia y fuera del objetivo. Además, estos nanomedicamentos tienen una alta penetración tisular, lo que los convierte en un candidato deseable para la administración y el tratamiento de fármacos para tumores profundos. Los aptámeros también pueden diseñarse para dirigirse a los transportadores expresados en la barrera hematoencefálica (BBB) para mejorar la administración de fármacos a los tumores cerebrales9. Un buen ejemplo de tal aptámero son los aptámeros bifuncionales, dirigidos al receptor de transferrina (TfR)10 para mejorar la administración del fármaco a través de la barrera hematoencefálica, y la entrega de una carga útil de fármaco citotóxico a las células tumorales11.
A pesar de todas las ventajas de los aptámeros, el desarrollo de fármacos en este campo aún no ha producido un medicamento contra el cáncer comercializado y exitoso. Una razón para esto podría ser la falta de métodos estándar y reproducibles que puedan ser seguidos globalmente por los investigadores en el campo. En este artículo, se demuestra un protocolo paso a paso de un aptámero que se une a una proteína nativa expresada en la superficie celular. Este protocolo es un paso previo en la evaluación preclínica de los aptámeros anticancerosos. El ensayo se realiza para mostrar la selectividad y especificidad del aptámero purificado recogido de SELEX o una secuencia de aptámeros publicada para confirmar la selectividad y la especificidad. Este ensayo basado en citometría de flujo es un ensayo rápido, confiable y sensible que muestra con precisión la selectividad y especificidad del aptámero, donde el aptámero se está probando contra proteínas en la superficie celular12,13,14. Este método se demuestra utilizando la unión de un aptámero específico para EpCAM que se muestra en este documento15. La EpCAM, como glicoproteína transmembrana, desempeña un papel en la señalización, progresión, migración y metástasis de las células tumorales16,17. Para mostrar la selectividad y especificidad de este aptámero, se utilizaron células cancerosas EpCAM positivas y negativas. El aptámero específico de EpCAM previamente desarrollado, TEPP (5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′), y un aptámero de control negativo, TENN (5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3), se utilizaron como aptámeros de unión a EpCAM y no vinculantes, respectivamente10. El extremo 3′ de TEPP y TENN se etiquetó con un fluoróforo TYE665.
TEPP es un aptámero bifuncional que se dirige a EpCAM por un extremo y TfR por el otro. Esto ha hecho de TEPP un candidato adecuado para la administración de fármacos a los tumores cerebrales EpCAM+ . Usando su extremo específico de TfR, TEPP atraviesa la barrera hematoencefálica y, utilizando el extremo específico de EpCAM, encuentra el tumor y entrega su carga (por ejemplo, medicamentos citotóxicos) al tumor. TENN tiene una longitud y estructura 2D similares a TEPP, pero no tiene afinidad con la EpCAM o TfR, y por lo tanto es un aptámero de control negativo adecuado. Usando TEPP y TENN, la prueba de la unión de un aptámero a la proteína diana mediante citometría de flujo se muestra en este documento. Este protocolo se aplica al desarrollo de aptámeros específicos de células. También es aplicable a otros análisis complementarios y de confirmación de las secuencias de aptámeros disponibles en la literatura. El protocolo también puede ser utilizado por aquellos nuevos en el campo de los aptámeros que están buscando usar un aptámero previamente publicado para sus fines de investigación y desarrollo (R&D). En este trabajo, se estudian dos secuencias de aptámeros disponibles en la literatura.
Protocol
Representative Results
Discussion
El desafío clave con el desarrollo de nuevos aptámeros es la falta de directrices estándar que se aplican a los diferentes pasos de este proceso. McKeague et al. han demostrado recientemente algunos de los desafíos asociados, que conducen a presentaciones poco claras de los datos en las publicaciones y al fracaso de replicar la investigación. Propusieron directrices fundamentales necesarias para su consideración en la caracterización de aptámeros19. Un ensayo de unión de aptámeros es un …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen la financiación de SEED del Instituto de Salud Mental y Física y Traducción Clínica (IMPACT), el programa “Alfred Deakin Postdoctoral Research Fellowship” en la Universidad de Deakin y la “Beca del Programa de Capacitación en Investigación del Gobierno de Australia”.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes with attached lid | Sigma-Aldrich | T6649 | |
| 15 mL CellStar blue screw cap, conical bottom tube | Greiner Bio One | 188271 | |
| 5 mL serological pipettes | Greiner Bio One | 606180 | |
| BD FACSCanto II Flow Becton Dickinson Cytometer | Becton Dickinson | N/A | |
| BD FACSDiva V9.0 | BD Biosciences | N/A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Lyophilized powder | Sigma-AldrichTM | A7906-50G | |
| Bright-line Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose Media Powder | Life Technologies | 12100046 | |
| Dulbecco’s Phosphate- Buffered Saline (DPBS) | Life Technologies | 21300025 | |
| FlowJo, LLC 10.8.1 | BD Biosciences | N/A | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
| HEK293T | American Type Culture Collection | ACS-4500 | |
| Heracell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Heraeus Megafuge 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
| Microplate, PS, 96 well, F-bottom (Chimney well), Black | Greiner Bio One | 655076 | |
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) tablets | Life Technologies | 18912014 | |
| Pyrogen- and RNase-free ultrapure water | Milli-Q | ||
| T75 Cell Culture flask | Cellstar | 658170 | |
| TENN | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3 |
| TEPP | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′ |
| Transfer RNA (tRNA) | Sigma-Aldrich | R8508-5X1ML | |
| Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 |
Riferimenti
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