Avaliação da ativação da caspase para avaliar a morte de células imunes inatas

Summary

Este protocolo descreve um método abrangente para avaliar a ativação da caspase (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9 e caspase-11) em resposta a modelos in vitro e in vivo (em camundongos) de infecção, insultos estéreis e câncer para determinar o início de vias de morte celular, como piroptose, apoptose, necroptose e PANoptose.

Abstract

A imunidade inata fornece a primeira linha crítica de defesa em resposta a patógenos e insultos estéreis. Um componente mecanicista chave dessa resposta é o início da morte celular imune programada inata (PCD) para eliminar células infectadas ou danificadas e propagar respostas imunes. No entanto, o excesso de PCD está associado à inflamação e patologia. Portanto, entender a ativação e a regulação da PCD é um aspecto central da caracterização das respostas imunes inatas e da identificação de novos alvos terapêuticos em todo o espectro da doença.

Este protocolo fornece métodos para caracterizar a ativação inata da PCD imune monitorando caspases, uma família de proteases dependentes de cisteína que são frequentemente associadas a diversas vias da PCD, incluindo apoptose, pirotose, necroptose e PANoptose. Os relatos iniciais caracterizaram caspase-2, caspase-8, caspase-9 e caspase-10 como caspases iniciadoras e caspase-3, caspase-6 e caspase-7 como caspases efetoras na apoptose, enquanto estudos posteriores encontraram as caspases inflamatórias, caspase-1, caspase-4, caspase-5 e caspase-11, impulsionam a piroptose. Sabe-se agora que há uma extensa conversa cruzada entre as caspases e outras moléculas inatas imunes e de morte celular através das vias PCD previamente definidas, identificando uma lacuna de conhecimento fundamental na compreensão mecanicista da imunidade inata e PCD e levando à caracterização da PANoptosis. A PANoptose é uma via inata de PCD inflamatória imune única regulada por complexos PANoptosome, que integram componentes, incluindo caspases, de outras vias de morte celular.

Aqui, métodos para avaliar a ativação de caspases em resposta a vários estímulos são fornecidos. Esses métodos permitem a caracterização das vias de PCD tanto in vitro quanto in vivo, uma vez que as caspases ativadas sofrem clivagem proteolítica que pode ser visualizada por western blotting usando anticorpos ideais e condições de blotting. Foi estabelecido um protocolo e um fluxo de trabalho de western blotting que permitem a avaliação da ativação de múltiplas caspases de uma mesma população celular, proporcionando uma caracterização abrangente dos processos de PCD. Este método pode ser aplicado em todas as áreas de pesquisa em desenvolvimento, homeostase, infecção, inflamação e câncer para avaliar as vias PCD em todos os processos celulares na saúde e na doença.

Introduction

O sistema imunológico inato atua como a primeira linha de defesa durante a infecção e em resposta a estímulos estéreis, como lesão tecidual e alterações na homeostase. Sensores imunes inatos na superfície celular e no citoplasma respondem a padrões moleculares associados a patógenos ou danos (PAMPs ou DAMPs, respectivamente) para desencadear vias de sinalização inflamatória e respostas celulares. Um dos principais processos da resposta imune inata é a indução da morte celular para remover células infectadas ou danificadas e impulsionar ainda mais respostas imunes inatas e adaptativas. A morte celular programada (PCD) é um processo altamente conservado em todas as espécies, destacando sua importância evolutiva como um mecanismo imunológico inato.

Existem várias vias inatas de PCD imunes que podem ser ativadas em todos os tipos de células. As caspases são uma família-chave de proteases altamente conservadas, intracelulares e dependentes de cisteína que são críticas em muitas vias de PCD, incluindo a via de apoptose tradicionalmente não inflamatória, bem como vias inflamatórias de PCD, como piroptose, necroptose e PANoptose 1,2,3,4,5 . Existem 11 caspases humanas e 10 murinas que estão bem definidas, bem como pseudocaspases que podem ser funcionais, e a maioria é expressa constitutivamente como pró-caspases monoméricas ou diméricas inativas que requerem clivagem para ativação ^6,7. As caspases também contêm domínios importantes para o recrutamento e formação de complexos multiproteicos. Estes incluem o domínio de ativação e recrutamento da caspase (CARD), que pode ser encontrado na caspase-1, caspase-2, caspase-4, caspase-5, caspase-9 e caspase-11, ou o domínio efetor da morte (DED), que é encontrado na caspase-8 e caspase-10. Através de sua atividade proteolítica e sua capacidade de formar complexos multiproteicos, as caspases são fatores críticos da PCD imune inata.

O papel das caspases na PCD imune inata foi identificado pela primeira vez na apoptose, onde as caspases iniciadoras, caspase-2, caspase-8, caspase-9 e caspase-10, ativam as caspases carrasco, caspase-3, caspase-6 e caspase-7, para conduzir a morte celular 8,9,10,11,12. As caspases do iniciador podem ser ativadas por diversas cascatas de sinalização; a via extrínseca ativa a caspase-8 através da sinalização do receptor de morte induzida por ligantes extracelulares, e a via intrínseca ativa a caspase-9 através da ruptura da integridade mitocondrial¹³. As caspases iniciadoras ativadas clivam o ligador separando as grandes e pequenas subunidades catalíticas das caspases do carrasco para produzir suas formas ativas. As caspases do carrasco então clivam seus substratos para desmontar a célula, resultando em degradação do DNA, blebbing da membrana, fragmentação nuclear e liberação de corpos apoptóticos^14,15. Esse processo geralmente termina em uma forma não lítica e não inflamatória de morte celular quando acoplado à depuração imediata das células moribundas por eferocitose¹⁶. No entanto, defeitos na eferocitose ou falta de células fagocíticas podem levar ao acúmulo de células apoptóticas, que então sofrem morte celular lítica e inflamatória^17,18.

As caspases inflamatórias, incluindo caspase-1 (humana e rato), caspase-4 e caspase-5 (humana) e caspase-11 (rato), foram descobertas para serem ativadas durante uma forma de PCD IMUNE INATA INFLAMATÓRIA (III-PCD) chamada piroptose. A ativação da caspase-1 está associada à formação de inflamassomas, que são complexos multiproteicos contendo um sensor imune inato citosólico, uma molécula adaptadora (proteína speck-like associada à apoptose contendo um CARD [ASC]) e caspase-1. A formação desse complexo permite que a caspase-1 sofra autoproteólise mediada por proximidade para liberar sua forma ativa, que pode clivar substratos-alvo, incluindo as citocinas pró-inflamatórias interleucina (IL)-1β e IL-18 e a molécula formadora de poros gasdermina D (GSDMD)19,20,21,22,23 . A casspase-11, a caspase-4 e a caspase-5 também podem ativar o GSDMD sem a formação a montante do inflamassoma após a detecção de PAMPs como o lipopolissacarídeo (LPS)^19,20. Essas caspases sofrem dimerização seguida de oligomerização e autoclivagem para ativação após a ligação ao LPS citosólico, o que leva à ativação do inflamassoma não canônico 24,25,26 e ativação da caspase-1 de forma intrínseca à célula para induzir a maturação da IL-1β e IL-18 ²⁰. A maturação e a liberação dessas citocinas pró-inflamatórias caracterizam essas caspases como “inflamatórias”. Além disso, descobriu-se que a caspase-8 apoptótica localiza-se no inflamassoma, fornecendo uma ligação entre os processos apoptóticos e piropóticos. Estudos descobriram que a caspase-8 apoptótica também é crítica para regular outra forma de PCD chamada necroptose. A perda de caspase-8 resulta na ativação espontânea de serina-treonina quinase 3 (RIPK3) mediada por uma pseudoquinase de linhagem mista mediada por receptores (MLKL) para conduzir a via III-PCD da necroptose 27,28,29,30,31,32,33,34,35.

Embora as caspases tenham sido historicamente classificadas como “apoptóticas” ou “inflamatórias” com base no tipo de morte celular que iniciam, evidências crescentes sugerem que há uma extensa conversa cruzada entre as vias inatas da PCD imune através das caspases ^3,4. Por exemplo, a caspase-1 inflamatória dos inflamassomos cliva a caspase-7 apoptótica em seu local de ativação canônica³⁴. A ativação da caspase-1 também pode levar à clivagem de substratos apoptóticos, como a poli(ADP-ribose) polimerase 1 (PARP1)³⁶. Em células sem GSDMD, a caspase-1 também pode clivar a caspase-3^37,38. Além disso, a caspase-3 canonicamente apoptótica pode clivar a gasdermina E (GSDME) para induzir a PCD^17,18 e também processa a GSDMD em uma forma inativa⁴⁰. Além disso, o recrutamento da caspase-8 para o complexo inflamassoma tem sido observado 39,40,41,42,43,44,45^, e a caspase-8 é um regulador chave da ativação do inflamassoma canônico e não canônico ³⁹. Há também papéis sobrepostos e redundantes para a caspase-8 e a caspase-1 em muitas condições inflamatórias, e a PCD imune inata caracterizada pela ativação de componentes piropóticos, apoptóticos e necroptóticos ocorre em todo o espectro da doença 39,46,47,48,49,50.

Com base nesse crosstalk entre caspases inflamatórias e apoptóticas, uma lacuna fundamental na compreensão mecanicista da imunidade inata e PCD foi identificada, levando à descoberta da PANoptosis. A PANoptose é uma forma única de III-PCD que é ativada em resposta a patógenos, PAMPs, DAMPs e alterações na homeostase e é regulada por PANoptossomos – complexos macromoleculares multifacetados que integram componentes de outras vias de morte celular 44,50,51,52,53,54,55 . A totalidade dos efeitos biológicos na PANoptose não pode ser individualmente explicada por piroptose, apoptose ou necroptose isoladamente 3,4,35,36,39,46,47,48, uma vez que a PANoptose é caracterizada pela ativação de múltiplas caspases, incluindo caspase-1, caspase-11, caspase-8, caspase-9, caspase-3 e/ou caspase-7^, dependendo do contexto 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 . A PANoptose tem sido cada vez mais implicada em doenças infecciosas e inflamatórias, bem como em cânceres e terapias oncológicas 3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 ,^54,56
,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66.

Dado o papel essencial das caspases nas vias de morte celular, inclusive na apoptose, piroptose, necroptose e PANoptose, é importante desenvolver técnicas para caracterizar sua ativação e compreender toda a complexidade das vias da PCD. O protocolo aqui detalha um método para estimular as células e medir a ativação subsequente das caspases (Figura 1). Este método aproveita a clivagem proteolítica das caspases, que geralmente é necessária para a sua ativação, como um meio de estudá-las. Através do western blotting, os tamanhos das proteínas podem ser determinados, permitindo a visualização clara e diferenciação de pró-caspases inativas e suas formas ativadas e clivas.

As principais vantagens deste protocolo são 1) sua capacidade de avaliar a ativação de múltiplas caspases em paralelo a partir de uma única população de células endógenas para determinar com mais precisão a ativação da PCD e 2) o uso de técnicas laboratoriais relativamente simples que não requerem treinamento extensivo ou equipamentos caros. Protocolos anteriores usaram western blotting, repórteres fluorescentes ou coloração de anticorpos para monitorar a ativação da caspase em sobrenadantes de cultura, lisados celulares e teciduais, células inteiras via microscopia e in vivo 67,68,69,70,71^, mas essas técnicas geralmente monitoram apenas uma ou duas caspases em uma amostra. Além disso, enquanto substratos peptídicos sintéticos contendo sítios de clivagem da caspase que fluorescem sobre a clivagem têm sido usados para monitorar a ativação da caspase em lisados celulares ou teciduais⁶⁹, esses substratos muitas vezes podem ser clivados por mais de uma caspase, dificultando a determinação da ativação específica de caspases individuais neste sistema. Além disso, o uso de western blotting em vez do uso de repórteres fluorescentes ou outros métodos baseados em tags permite que os pesquisadores usem células endógenas em vez de criar linhagens celulares específicas com genes repórteres. Existem múltiplas vantagens no uso de células endógenas, incluindo o fato de que muitas linhagens celulares imortalizadas são deficientes em moléculas-chave de morte celular^72,73, o que poderia afetar os resultados. Além disso, o uso de células endógenas permite a avaliação de diversos tipos de células, como macrófagos, células epiteliais e células endoteliais, em vez de uma única linhagem. Western blotting também é uma técnica relativamente simples e econômica que pode ser realizada em laboratórios em todo o mundo sem a necessidade de equipamentos grandes e caros ou configurações complicadas.

Esse protocolo é amplamente aplicável em toda a biologia para entender as funções dependentes da morte celular e independentes da morte celular das caspases, incluindo seus papéis e funções de andaimes em outras vias de sinalização inflamatória⁷⁴. A aplicação deste método permite uma abordagem unificada no estudo das vias inatas da PCD imune e da sinalização inflamatória entre doenças e condições, e este protocolo pode ser usado para identificar processos regulatórios críticos e conexões mecanicistas que informarão o desenvolvimento de futuras estratégias terapêuticas.

Protocol

O uso e os procedimentos dos animais foram aprovados pelo Comitê de Pesquisa do Hospital Infantil St. Jude sobre o Uso e Cuidado dos Animais. 1. Preparação das soluções Prepare a mídia condicionada por L929.A placa 1 × 106 células L929 (ver Tabela de Materiais) num balão de cultura de tecidos de182 cm 2 contendo 50 ml de meios de cultura L929 (ver Tabela 1 para a preparação do meio). <l…

Representative Results

PANoptosis tem sido observada em resposta a numerosas infecções bacterianas, virais e fúngicas e outros estímulos inflamatórios, bem como em células cancerosas 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,60,61,62 <su…

Discussion

O monitoramento da clivagem e ativação da caspase fornece uma das imagens mais abrangentes da ativação inata do PCD imune como parte da resposta imune inata. O protocolo aqui descrito demonstra uma estratégia para monitorar a ativação da caspase em resposta às infecções por IAV, HSV1 e F. novicida e ao gatilho estéril LPS + ATP, mas inúmeros outros estímulos podem induzir PCD e poderiam ser utilizados nesse método, como tem sido demonstrado em várias publicações 44,48,49,50,51,52,53,54,56<sup cl…

Materials

0.45 μm filter	Millipore	SCHVU05RE
10 mL syringe	BD Biosciences	309604
12% polyacrylamide gel with 10 wells	Bio-Rad	4561043
12-well plate	Corning	07-200-82
18 G needle	BD Biosciences	305195
25 G needle	BD Biosciences	305122
50 mL tube	Fisher Scientific	50-809-218
70 μm cell strainer	Corning	431751
150 mm tissue culture dishes	Corning	430597
182-cm2 tissue culture flask	Genesee Scientific	25-211
Accessory white trans tray	Cytiva	29-0834-18
Anti–caspase-1 antibody	AdipoGen	AG-20B-0042-C100
Anti–caspase-11 antibody	Novus Biologicals	NB120-10454
Anti–caspase-3 antibody	Cell Signaling Technology	9662
Anti–caspase-7 antibody	Cell Signaling Technology	9492
Anti–caspase-8 antibody	Cell Signaling Technology	4927
Anti–caspase-9 antibody	Cell Signaling Technology	9504
Anti–cleaved caspase-3 antibody	Cell Signaling Technology	9661
Anti–cleaved caspase-7 antibody	Cell Signaling Technology	9491
Anti–cleaved caspase-8 antibody	Cell Signaling Technology	8592
Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody	Jackson ImmunoResearch Laboratories	315-035-047
Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-035-047
Anti-rat HRP-conjugated secondary antibody	Jackson ImmunoResearch Laboratories	112-035-003
Anti–β-Actin antibody (C4) HRP	Santa Cruz	sc-47778 HRP
ATP	InvivoGen	tlrl-atpl
BBL Trypticase Soy Broth	BD Biosciences	211768
Bead bath	Chemglass Life Sciences	CLS-4598-009
Biophotometer D30	Eppendorf	6133000010
BME	Sigma	M6250
Bromophenol blue	Sigma	BO126
Cell scrapers	CellTreat Scientific Products	229315
Chemiluminescence imager (Amersham 600)	Cytiva	29083461
CO2 chamber	VetEquip	901703
Cuvettes	Fisher Scientific	14-955-129
Dissecting scissors	Thermo Fisher Scientific	221S
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11995-073
DTT	Sigma	43815
Eelectrophoresis apparatus	Bio-Rad	1658004
Ethanol	Pharmco	111000200
Fetal bovine serum	Biowest	S1620
Filter paper	Bio-Rad	1703965
Forceps	Fisher Scientific	22-327379
Francisella novicida (U112 strain)	BEI Resources	NR-13
Gel releaser	Bio-Rad	1653320
Gentamycin	Gibco	15750060
Glycerol	Sigma	G7893
Glycine	Sigma	G8898
HCl	Sigma	H9892
Heat block	Fisher Scientific	23-043-160
Herpes simplex virus 1 (HF strain)	ATCC	VR-260
High glucose DMEM	Sigma	D6171
Human anti–caspase-1 antibody	R&D Systems	MAB6215
Human anti–caspase-8 antibody	Enzo	ALX-804-242
Humidified incubator	Thermo Fisher Scientific	51026282
Image analysis software	ImageJ	v1.53a
IMDM	Thermo Fisher Scientific	12440-053
Influenza A virus (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8])	constructed per Hoffmann et al.
L929 cells	ATCC	CCL-1	cell line for creating L929-conditioned media
L-cysteine	Thermo Fisher Scientific	BP376-100
Luminata Forte Western HRP substrate	Millipore	WBLUF0500	standard-sensitivity HRP substrate
MDCK cells	ATCC	CCL-34	cell line for determining IAV viral titer
Methanol	Sigma	322415
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002401
Non-essential amino acids	Gibco	11140050
Nonfat dried milk powder	Kroger
NP-40 solution	Sigma	492016
PBS	Thermo Fisher Scientific	10010023
Penicillin and streptomycin	Sigma	P4333
Petri dish	Fisher Scientific	07-202-011
PhosSTOP	Roche	PHOSS-RO
Power source	Bio-Rad	164-5052
Protease inhibitor tablet	Sigma	S8820
PVDF membrane	Millipore	IPVH00010
Rocking shaker	Labnet	S2035-E
SDS	Sigma	L3771
Sodium chloride	Sigma	S9888
Sodium deoxycholate	Sigma	30970
Sodium hydroxide	Sigma	72068
Sodium pyruvate	Gibco	11360-070
Square Petri dish	Fisher Scientific	FB0875711A
Stripping buffer	Thermo Fisher Scientific	21059
Super Signal Femto HRP substrate	Thermo Fisher Scientific	34580	high-sensitivity HRP substrate
Tabletop centrifuge	Thermo Fisher Scientific	75004524
Trans-Blot semi-dry system	Bio-Rad	170-3940
Tris	Sigma	TRIS-RO
Tween 20	Sigma	P1379
Ultrapure lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4	InvivoGen	tlrl-3pelps
Vero cells	ATCC	CCL-81	cell line for determining HSV1 viral titer