JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologia e infezioni

הערכת הפעלת קספז להערכת מוות מולד של תאי מערכת החיסון

Published: January 20, 2023
doi:
10.3791/64308
, ,
1Department of Immunology,St. Jude Children’s Research Hospital

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה מקיפה להערכת הפעלת קספאז (קספאז-1, קספאז-3, קספאז-7, קספאז-8, קספאז-9 וקספאז-11) בתגובה הן למודלים במבחנה והן ב-in vivo (בעכברים) של זיהום, עלבונות סטריליים וסרטן כדי לקבוע את התחלתם של מסלולי מוות תאי, כגון פירופטוזיס, אפופטוזיס, נקרופטוזיס ו-PANoptosis.

Abstract

חסינות מולדת מספקת את קו ההגנה הראשון הקריטי בתגובה לפתוגנים ולעלבונות סטריליים. מרכיב מכניסטי מרכזי בתגובה זו הוא התחלת מוות תאי מתוכנת חיסוני מולד (PCD) כדי לחסל תאים נגועים או פגומים ולהפיץ תגובות חיסוניות. עם זאת, עודף PCD קשור דלקת ופתולוגיה. לכן, הבנת ההפעלה והוויסות של PCD היא היבט מרכזי באפיון תגובות חיסוניות מולדות ובזיהוי מטרות טיפוליות חדשות על פני ספקטרום המחלה.

פרוטוקול זה מספק שיטות לאפיון הפעלת PCD חיסונית מולדת על ידי ניטור קספזות, משפחה של פרוטאזות תלויות ציסטאין הקשורות לעתים קרובות למסלולי PCD מגוונים, כולל אפופטוזיס, פירופטוזיס, נקרופטוזיס ו- PANoptosis. דיווחים ראשוניים אפיינו את קספאז-2, קספאז-8, קספאז-9 וקספאז-10 כקספזות יוזמות ואת קספאז-3, קספאז-6 וקספאז-7 כקספזות משפיעות באפופטוזיס, בעוד שמחקרים מאוחרים יותר מצאו שהקספזות הדלקתיות, קספאז-1, קספאז-4, קספאז-5 וקספאז-11, מניעות פירופטוזיס. כיום ידוע כי קיימת הצלבה נרחבת בין הקספזות לבין מולקולות אחרות של מערכת החיסון המולדת ומוות תאי על פני מסלולי PCD שהוגדרו קודם לכן, מה שזיהה פער ידע מרכזי בהבנה המכניסטית של חסינות מולדת ו-PCD והוביל לאפיון של PANoptosis. PANoptosis הוא מסלול PCD דלקתי חיסוני מולד ייחודי המווסת על ידי קומפלקסים של PANoptosome, המשלבים רכיבים, כולל קספזות, ממסלולי מוות תאים אחרים.

כאן ניתנות שיטות להערכת הפעלת קספזות בתגובה לגירויים שונים. שיטות אלו מאפשרות אפיון של מסלולי PCD הן במבחנה והן in vivo, כאשר קספזות פעילות עוברות מחשוף פרוטאוליטי שניתן להמחיש על ידי כתם מערבי באמצעות נוגדנים אופטימליים ותנאי כתש. נקבעו פרוטוקול וזרימת עבודה מערבית המאפשרים הערכה של הפעלה של קספזות מרובות מאותה אוכלוסייה סלולרית, ומספקים אפיון מקיף של תהליכי PCD. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על פני תחומי מחקר בפיתוח, הומאוסטזיס, זיהום, דלקת וסרטן כדי להעריך מסלולי PCD לאורך תהליכים תאיים בבריאות ובמחלות.

Introduction

מערכת החיסון המולדת פועלת כקו ההגנה הראשון במהלך זיהום ובתגובה לגירויים סטריליים, כגון פגיעה ברקמות ושינויים בהומאוסטזיס. חיישנים חיסוניים מולדים על פני התא ובציטופלסמה מגיבים לדפוסים מולקולריים הקשורים לפתוגן או נזק (PAMPs או DAMPs, בהתאמה) כדי להפעיל מסלולי איתות דלקתיים ותגובות תאיות. אחד התהליכים המרכזיים של התגובה החיסונית המולדת הוא השראת מוות תאי כדי להסיר תאים נגועים או פגומים ולהניע תגובות חיסוניות מולדות ונרכשות נוספות. מוות תאי מתוכנת (PCD) הוא תהליך שמור מאוד בין מינים, מה שמדגיש את חשיבותו האבולוציונית כמנגנון חיסוני מולד.

ישנם מספר מסלולי PCD חיסוניים מולדים שיכולים להיות מופעלים בכל סוגי התאים. קספזות הן משפחת מפתח של פרוטאזות תלויות ציסטאין שהשתמרו מאוד, תוך תאיות ותלויות ציסטאין, שהן קריטיות במסלולי PCD רבים, כולל מסלול אפופטוזיס לא דלקתי מסורתי, כמו גם מסלולי PCD דלקתיים כמו פירופטוזיס, נקרופטוזיס ו-PANoptosis 1,2,3,4,5 . ישנם 11 קספזות אנושיות ו -10 קספזות מורין המוגדרות היטב, כמו גם פסאודו-קספזות שעשויות להיות פונקציונליות, ורובן מבוטאות באופן מכונן כפרו-קספזות מונומריות או דימריות לא פעילות הדורשות מחשוף להפעלה 6,7. Caspases מכילים גם תחומים חשובים עבור גיוס והיווצרות של מתחמי multiprotein. אלה כוללים את תחום ההפעלה והגיוס של קספאז (CARD), שניתן למצוא בקספאז-1, קספאז-2, קספאז-4, קספאז-5, קספאז-9 וקספאז-11, או תחום אפקט המוות (DED), שנמצא בקספאז-8 ובקספאז-10. הן באמצעות הפעילות הפרוטאוליטית שלהם והן באמצעות יכולתם ליצור קומפלקסים של מולטי-חלבונים, קספזות הן מניעים קריטיים של PCD חיסוני מולד.

תפקידן של קספזות ב-PCD של מערכת החיסון המולדת זוהה לראשונה באפופטוזיס, כאשר הקספזות היוזמות, קספאז-2, קספאז-8, קספאז-9 וקספאז-10, מפעילות את קספזות התליינים, קספאז-3, קספאז-6 וקספאז-7, כדי לגרום למוות תאי 8,9,10,11,12. קספזות יוזמות יכולות להיות מופעלות על ידי מפל איתות מגוון; המסלול החיצוני מפעיל את קספאז-8 באמצעות איתות קולטן מוות חוץ-תאי המושרה על ידי ליגנד, והמסלול הפנימי מפעיל את קספאז-9 באמצעות הפרעה לשלמות המיטוכונדריה13. קספזות יוזמות מופעלות מנתקות את המקשר המפריד בין תת-היחידות הקטליטיות הגדולות והקטנות של קספזות התליין כדי לייצר את צורתן הפעילה. לאחר מכן, קספזות התליין קורעות את הסובסטרטים שלהן כדי לפרק את התא, וכתוצאה מכך מתפרקת הדנ”א, ממברנות מפוצלות, פיצול גרעיני ושחרור גופים אפופטוטיים14,15. תהליך זה מסתיים בדרך כלל בצורה לא ליטית ולא דלקתית של מוות תאי כאשר הוא יחד עם פינוי מיידי של התאים הגוססים על ידי אפרוציטוזה16. עם זאת, פגמים efferocytosis או חוסר תאים phagocytic יכול להוביל הצטברות של תאים אפופטוטיים, אשר לאחר מכן לעבור מוות תאים ליטיים ודלקתיים17,18.

הקספזות הדלקתיות, כולל קספאז-1 (אדם ועכבר), קספאז-4 וקספאז-5 (אדם) וקספאז-11 (עכבר), התגלו כמופעלות במהלך צורה של PCD (III-PCD) דלקתי של מערכת החיסון המולדת הנקראת פירופטוזיס. הפעלת קספאז-1 קשורה להיווצרות של דלקתיות, שהן קומפלקסים רב-חלבוניים המכילים חיישן חיסוני מולד ציטוסולי, מולקולת מתאם (חלבון דמוי גרגיר הקשור לאפופטוזיס המכיל CARD [ASC]) וקספאז-1. היווצרות קומפלקס זה מאפשרת לקספאז-1 לעבור אוטופרוטאוליזה בתיווך קרבה כדי לשחרר את צורתו הפעילה, אשר יכולה לבקע את מצעי המטרה כולל הציטוקינים מעודדי הדלקת אינטרלוקין (IL)-1β ו- IL-18 ומולקולה יוצרת הנקבוביות Gasdermin D (GSDMD)19,20,21,22,23 . קספאז-11, קספאז-4 וקספאז-5 יכולים גם להפעיל GSDMD ללא היווצרות מעלה הזרם של הדלקתיות לאחר חישה של PAMPs כגון ליפופוליסכריד (LPS)19,20. קספזות אלה עוברות דימריזציה ואחריה אוליגומריזציה ומחשוף עצמי להפעלה עם קשירה ל- LPS ציטוסולי, מה שמוביל להפעלה דלקתית לא קנונית 24,25,26 והפעלת קספאז-1 באופן פנימי לתאים כדי לגרום להבשלת IL-1β ו- IL-18 20. ההבשלה והשחרור של ציטוקינים מעודדי דלקת אלה מאפיינים קספזות אלה כ”דלקתיות”. בנוסף, נמצא כי הקספאז-8 האפופטוטי מתמקם בדלקת, ומספק קשר בין תהליכים אפופטוטיים ופירופטוטיים. מחקרים מצאו כי קספאז-8 אפופטוטי הוא גם קריטי לוויסות צורה אחרת של PCD הנקראת נקרופטוזיס. אובדן קספאז-8 גורם לאינטראקציה ספונטנית של קולטן סרין-תראונין קינאז 3 (RIPK3) בתיווך שושלת מעורבת קינאז דמוי תחום פסאודוקינאז (MLKL) כדי להניע את מסלול III-PCD של נקרופטוזיס 27,28,29,30,31,32,33,34,35.

בעוד שקספזות סווגו בעבר כ”אפופטוטיות” או “דלקתיות” בהתבסס על סוג המוות התאי שהן יוזמות, עדויות הולכות וגדלות מצביעות על כך שיש הצלבה נרחבת בין מסלולי PCD של מערכת החיסון המולדת דרך קספזות 3,4. לדוגמה, הקספאז-1 הדלקתי מדלקת קוטע את הקספאז-7 האפופטוטי באתר ההפעלה הקנוני שלו34. הפעלת קספאז-1 יכולה גם להוביל לפיצול של מצעים אפופטוטיים כגון פולי(ADP-ריבוז) פולימראז 1 (PARP1)36. בתאים חסרי GSDMD, קספאז-1 יכול גם לבקע קספאז-337,38. בנוסף, קספאז-3 אפופטוטי קנוני יכול לבקע gasdermin E (GSDME) כדי לגרום PCD17,18 וגם מעבד GSDMD לתוך צורהלא פעילה 40. יתר על כן, גיוס קספאז-8 לקומפלקס הדלקתי נצפה 39,40,41,42,43,44,45, וקספאז-8 הוא וסת מרכזי של הפעלה דלקתית קנונית ולא קנונית 39. ישנם גם תפקידים חופפים ומיותרים עבור קספאז-8 וקספאז-1 במצבים דלקתיים רבים, ו-PCD חיסוני מולד המאופיין בהפעלת רכיבים פירופטוטיים, אפופטוטיים ונקרופטוטיים, מתרחש על פני ספקטרום המחלה 39,46,47,48,49,50.

בהתבסס על קשר גומלין זה בין קספזות דלקתיות ואפופטוטיות, זוהה פער מרכזי בהבנה המכניסטית של חסינות מולדת ו- PCD, מה שהוביל לגילוי PANoptosis. PANoptosis היא צורה ייחודית של III-PCD המופעלת בתגובה לפתוגנים, PAMPs, DAMPs ושינויים בהומאוסטזיס ומווסתת על ידי PANoptosomes – קומפלקסים מקרומולקולריים רבגוניים המשלבים רכיבים ממסלולי מוות תאי אחרים 44,50,51,52,53,54,55 . מכלול ההשפעות הביולוגיות ב-PANoptosis אינו יכול להיות מוסבר באופן אינדיבידואלי על ידי פירופטוזיס, אפופטוזיס או נקרופטוזיס בלבד 3,4,35,36,39,46,47,48, שכן PANoptosis מאופיין בהפעלה של קספזות מרובות, כולל קספאז-1, קספאז-11, קספאז-8, קספאז-9, קספאז-3 ו/או קספאז-7, בהתאם להקשר 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 . PANoptosis היה מעורב יותר ויותר במחלות זיהומיות ודלקתיות, כמו גם בסרטן וטיפולים בסרטן 3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 ,54,56
,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66.

בהתחשב בתפקיד החיוני של קספזות על פני מסלולי מוות תאי, כולל אפופטוזיס, פירופטוזיס, נקרופטוזיס, ו PANoptosis, חשוב לפתח טכניקות כדי לאפיין את ההפעלה שלהם ולהבין את המורכבות המלאה של מסלולי PCD. הפרוטוקול כאן מפרט שיטה לגרות תאים ולמדוד את ההפעלה הבאה של קספזות (איור 1). שיטה זו ממנפת את המחשוף הפרוטאוליטי של קספזות, הנדרש בדרך כלל להפעלתן, כאמצעי לחקור אותן. באמצעות כתמים מערביים, ניתן לקבוע את גודל החלבון, המאפשר הדמיה ברורה והתמיינות של פרו-קספזות לא פעילות וצורתן הפעילה והשסועה.

היתרונות העיקריים של פרוטוקול זה הם: 1) יכולתו להעריך את ההפעלה של מספר קספזות במקביל מאוכלוסייה אחת של תאים אנדוגניים כדי לקבוע בצורה מדויקת יותר את הפעלת PCD, 2) שימוש בטכניקות מעבדה פשוטות יחסית שאינן דורשות הכשרה מקיפה או ציוד יקר. פרוטוקולים קודמים השתמשו בכתם מערבי, בכתבים פלואורסצנטיים או בצביעת נוגדנים כדי לעקוב אחר הפעלת קספז בתרביות, בליזטים של תאים ורקמות, בתאים שלמים באמצעות מיקרוסקופיה, וב-in vivo 67,68,69,70,71, אך טכניקות אלה בדרך כלל מנטרות רק קספזה אחת או שתיים בדגימה. יתר על כן, בעוד שמצעים פפטידים סינתטיים המכילים אתרי מחשוף קספז הזורמים על המחשוף שימשו לניטור הפעלת קספז בליזטים של תאים או רקמות69, מצעים אלה יכולים לעתים קרובות להיבקע על ידי יותר מקספזה אחת, מה שמקשה לקבוע את ההפעלה הספציפית של קספזות בודדות במערכת זו. בנוסף, השימוש בכתם מערבי במקום שימוש בכתבים פלואורסצנטיים או שיטות מבוססות תגיות אחרות מאפשר לחוקרים להשתמש בתאים אנדוגניים במקום ליצור קווי תאים ספציפיים עם גנים של כתב. ישנם יתרונות רבים לשימוש בתאים אנדוגניים, כולל העובדה שקווי תאים אימורטליים רבים חסרים במולקולות מפתח של מוות תאי72,73, מה שעלול להשפיע על התוצאות. בנוסף, שימוש בתאים אנדוגניים מאפשר הערכה של סוגי תאים מגוונים, כגון מקרופאגים, תאי אפיתל ותאי אנדותל, ולא שושלת אחת. המלטות מערביות הן גם טכניקה פשוטה יחסית וחסכונית שניתן לבצע במעבדות ברחבי העולם ללא צורך בציוד גדול ויקר או התקנות מסובכות.

פרוטוקול זה מיושם באופן נרחב ברחבי הביולוגיה כדי להבין הן את התפקודים התלויים במוות תאי והן את התפקודים שאינם תלויים במוות תאי של קספזות, כולל תפקידי הפיגומים שלהם ותפקודם במסלולי איתות דלקתיים אחרים74. יישום שיטה זו מאפשר גישה אחידה בחקר מסלולי PCD חיסוניים מולדים ואיתות דלקתי על פני מחלות ותנאים, וניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לזהות תהליכים רגולטוריים קריטיים וקשרים מכניסטיים שיסייעו בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות עתידיות.

Protocol

השימוש בבעלי חיים והנהלים אושרו על ידי ועדת בית החולים למחקר לילדים סנט ג’וד לשימוש וטיפול בבעלי חיים. 1. הכנת הפתרונות הכינו מדיה מותנית L929.צלחת 1 × 106 תאים L929 (ראה טבלת חומרים) בבקבוק תרביתרקמה בגודל 182 ס”מ 2 המכיל 50 מ”ל של מצע תרבית L929 (רא…

Representative Results

PANoptosis נצפתה בתגובה לזיהומים חיידקיים, נגיפיים ופטרייתיים רבים וגירויים דלקתיים אחרים, כמו גם בתאים סרטניים 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,60,61,62<sup cla…

Discussion

ניטור הפיצול וההפעלה של הקספז מספק את אחת התמונות המקיפות ביותר של הפעלת PCD חיסוני מולד כחלק מהתגובה החיסונית המולדת. הפרוטוקול המתואר כאן מדגים אסטרטגיה לניטור הפעלת קספז בתגובה לזיהומים IAV, HSV1 ו– F. novicida והטריגר הסטרילי LPS + ATP, אך גירויים רבים אחרים יכולים לגרום ל- PCD וניתן להשתמש בהם ב?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לחברי מעבדת Kanneganti על הערותיהם והצעותיהם, ומודים ל- J. Gullett, PhD, על התמיכה בעריכה מדעית. העבודה במעבדה שלנו נתמכת על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) AI101935, AI124346, AI160179, AR056296 ו- CA253095 (ל- T.-D.K.) ועל ידי ארגוני הצדקה האמריקאים הקשורים ללבנון הסורית (ל- T.-D.K). התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

Materials

0.45 μm filter Millipore SCHVU05RE
10 mL syringe BD Biosciences 309604
12% polyacrylamide gel with 10 wells  Bio-Rad 4561043
12-well plate  Corning 07-200-82
18 G needle  BD Biosciences 305195
25 G needle  BD Biosciences 305122
50 mL tube  Fisher Scientific 50-809-218
70 μm cell strainer  Corning 431751
150 mm tissue culture dishes Corning 430597
182-cm2 tissue culture flask Genesee Scientific 25-211
Accessory white trans tray Cytiva 29-0834-18
Anti–caspase-1 antibody AdipoGen AG-20B-0042-C100
Anti–caspase-11 antibody Novus Biologicals NB120-10454
Anti–caspase-3 antibody Cell Signaling Technology 9662
Anti–caspase-7 antibody Cell Signaling Technology 9492
Anti–caspase-8 antibody Cell Signaling Technology 4927
Anti–caspase-9 antibody Cell Signaling Technology 9504
Anti–cleaved caspase-3 antibody  Cell Signaling Technology 9661
Anti–cleaved caspase-7 antibody  Cell Signaling Technology 9491
Anti–cleaved caspase-8 antibody  Cell Signaling Technology 8592
Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 315-035-047
Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-047
Anti-rat HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 112-035-003
Anti–β-Actin antibody (C4) HRP Santa Cruz sc-47778 HRP
ATP InvivoGen tlrl-atpl
BBL Trypticase Soy Broth BD Biosciences 211768
Bead bath Chemglass Life Sciences CLS-4598-009
Biophotometer D30 Eppendorf 6133000010
BME Sigma M6250
Bromophenol blue  Sigma BO126
Cell scrapers CellTreat Scientific Products 229315
Chemiluminescence imager (Amersham 600)  Cytiva 29083461
CO2 chamber VetEquip 901703
Cuvettes Fisher Scientific 14-955-129
Dissecting scissors Thermo Fisher Scientific 221S
DMEM Thermo Fisher Scientific 11995-073
DTT Sigma 43815
Eelectrophoresis apparatus  Bio-Rad 1658004
Ethanol Pharmco 111000200
Fetal bovine serum  Biowest S1620
Filter paper Bio-Rad 1703965
Forceps Fisher Scientific 22-327379
Francisella novicida (U112 strain) BEI Resources NR-13
Gel releaser  Bio-Rad 1653320
Gentamycin Gibco 15750060
Glycerol Sigma G7893
Glycine Sigma G8898
HCl Sigma H9892
Heat block Fisher Scientific 23-043-160
Herpes simplex virus 1 (HF strain) ATCC VR-260
High glucose DMEM  Sigma D6171
Human anti–caspase-1 antibody R&D Systems MAB6215
Human anti–caspase-8 antibody Enzo ALX-804-242
Humidified incubator  Thermo Fisher Scientific 51026282
Image analysis software ImageJ v1.53a
IMDM Thermo Fisher Scientific 12440-053
Influenza A virus (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8])  constructed per Hoffmann et al.
L929 cells ATCC CCL-1 cell line for creating L929-conditioned media
L-cysteine  Thermo Fisher Scientific BP376-100
Luminata Forte Western HRP substrate Millipore WBLUF0500 standard-sensitivity HRP substrate
MDCK cells ATCC CCL-34 cell line for determining IAV viral titer
Methanol Sigma 322415
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002401
Non-essential amino acids  Gibco 11140050
Nonfat dried milk powder Kroger
NP-40 solution  Sigma 492016
PBS Thermo Fisher Scientific 10010023
Penicillin and streptomycin  Sigma P4333
Petri dish Fisher Scientific 07-202-011
PhosSTOP Roche PHOSS-RO
Power source  Bio-Rad 164-5052
Protease inhibitor tablet Sigma S8820
PVDF membrane  Millipore IPVH00010
Rocking shaker Labnet S2035-E
SDS Sigma L3771
Sodium chloride  Sigma S9888
Sodium deoxycholate Sigma 30970
Sodium hydroxide Sigma 72068
Sodium pyruvate  Gibco 11360-070
Square Petri dish Fisher Scientific FB0875711A
Stripping buffer Thermo Fisher Scientific 21059
Super Signal Femto HRP substrate Thermo Fisher Scientific 34580 high-sensitivity HRP substrate
Tabletop centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004524
Trans-Blot semi-dry system  Bio-Rad 170-3940
Tris Sigma TRIS-RO
Tween 20  Sigma P1379
Ultrapure lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 InvivoGen tlrl-3pelps
Vero cells ATCC CCL-81 cell line for determining HSV1 viral titer
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Alnemri, E. S., et al. Human ICE/CED-3 protease nomenclature. Cell. 87 (2), 171 (1996).
  2. Man, S. M., Kanneganti, T. D. Converging roles of caspases in inflammasome activation, cell death and innate immunity. Nature Reviews Immunology. 16 (1), 7-21 (2016).
  3. Gullett, J. M., Tweedell, R. E., Kanneganti, T. D. It’s all in the PAN: Crosstalk, plasticity, redundancies, switches, and interconnectedness encompassed by PANoptosis underlying the totality of cell death-associated biological effects. Cells. 11 (9), 1495 (2022).
  4. Pandian, N., Kanneganti, T. D. PANoptosis: A unique innate immune inflammatory cell death modality. Journal of Immunology. 209 (9), 1625-1633 (2022).
  5. Galluzzi, L., et al. Molecular mechanisms of cell death recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell Death & Differentiation. 25 (3), 486-541 (2018).
  6. Shi, Y. Caspase activation: Revisiting the induced proximity model. Cell. 117 (7), 855-858 (2004).
  7. Galluzzi, L., Lopez-Soto, A., Kumar, S., Kroemer, G. Caspases connect cell-death signaling to organismal homeostasis. Immunity. 44 (2), 221-231 (2016).
  8. Fernandes-Alnemri, T., Litwack, G., Alnemri, E. S. CPP32, a novel human apoptotic protein with homology to Caenorhabditis elegans cell death protein Ced-3 and mammalian interleukin-1 beta-converting enzyme. Journal of Biological Chemistry. 269 (49), 30761-30764 (1994).
  9. Tewari, M., et al. Yama/CPP32 beta, a mammalian homolog of CED-3, is a CrmA-inhibitable protease that cleaves the death substrate poly(ADP-ribose) polymerase. Cell. 81 (5), 801-809 (1995).
  10. Nicholson, D. W., et al. Identification and inhibition of the ICE/CED-3 protease necessary for mammalian apoptosis. Nature. 376 (6535), 37-43 (1995).
  11. Stennicke, H. R., et al. Pro-caspase-3 is a major physiologic target of caspase-8. Journal of Biological Chemistry. 273 (42), 27084-27090 (1998).
  12. Twiddy, D., Cohen, G. M., Macfarlane, M., Cain, K. Caspase-7 is directly activated by the approximately 700-kDa apoptosome complex and is released as a stable XIAP-caspase-7 approximately 200-kDa complex. Journal of Biological Chemistry. 281 (7), 3876-3888 (2006).
  13. Kesavardhana, S., Malireddi, R. K. S., Kanneganti, T. D. Caspases in cell death, inflammation, and pyroptosis. Annual Reviews of Immunology. 38, 567-595 (2020).
  14. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer. 26 (4), 239-257 (1972).
  15. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: Controlled demolition at the cellular level. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (3), 231-241 (2008).
  16. Morioka, S., Maueröder, C., Ravichandran, K. S. Living on the edge: Efferocytosis at the interface of homeostasis and pathology. Immunity. 50 (5), 1149-1162 (2019).
  17. Wang, Y., et al. Chemotherapy drugs induce pyroptosis through caspase-3 cleavage of a gasdermin. Nature. 547 (7661), 99-103 (2017).
  18. Rogers, C., et al. Cleavage of DFNA5 by caspase-3 during apoptosis mediates progression to secondary necrotic/pyroptotic cell death. Nature Communications. 8, 14128 (2017).
  19. Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling. Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).
  20. Shi, J., Gao, W., Shao, F. Pyroptosis: Gasdermin-mediated programmed necrotic cell death. Trends in Biochemical Sciences. 42 (4), 245-254 (2017).
  21. Sborgi, L., et al. GSDMD membrane pore formation constitutes the mechanism of pyroptotic cell death. EMBO Journal. 35 (16), 1766-1778 (2016).
  22. Aglietti, R. A., et al. GsdmD p30 elicited by caspase-11 during pyroptosis forms pores in membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (28), 7858-7863 (2016).
  23. Hagar, J. A., Powell, D. A., Aachoui, Y., Ernst, R. K., Miao, E. A. Cytoplasmic LPS activates caspase-11: implications in TLR4-independent endotoxic shock. Science. 341 (6151), 1250-1253 (2013).
  24. Kayagaki, N., et al. Noncanonical inflammasome activation by intracellular LPS independent of TLR4. Science. 341 (6151), 1246-1249 (2013).
  25. Shi, J., et al. Inflammatory caspases are innate immune receptors for intracellular LPS. Nature. 514 (7521), 187-192 (2014).
  26. Lamkanfi, M., et al. Targeted peptidecentric proteomics reveals caspase-7 as a substrate of the caspase-1 inflammasomes. Molecular & Cellular Proteomics. 7 (12), 2350-2363 (2008).
  27. Kalai, M., et al. Tipping the balance between necrosis and apoptosis in human and murine cells treated with interferon and dsRNA. Cell Death & Differentiation. 9 (9), 981-994 (2002).
  28. Li, C., et al. Development of atopic dermatitis-like skin disease from the chronic loss of epidermal caspase-8. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22249-22254 (2010).
  29. Kovalenko, A., et al. Caspase-8 deficiency in epidermal keratinocytes triggers an inflammatory skin disease. Journal of Experimental Medicine. 206 (10), 2161-2177 (2009).
  30. Kang, T. B., et al. Caspase-8 serves both apoptotic and nonapoptotic roles. Journal of Immunology. 173 (5), 2976-2984 (2004).
  31. Oberst, A., et al. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature. 471 (7338), 363-367 (2011).
  32. Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471 (7338), 368-372 (2011).
  33. Zhang, H., et al. Functional complementation between FADD and RIP1 in embryos and lymphocytes. Nature. 471 (7338), 373-376 (2011).
  34. Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
  35. Hitomi, J., et al. Identification of a molecular signaling network that regulates a cellular necrotic cell death pathway. Cell. 135 (7), 1311-1323 (2008).
  36. Malireddi, R. K., Ippagunta, S., Lamkanfi, M., Kanneganti, T. D. Cutting edge: Proteolytic inactivation of poly(ADP-ribose) polymerase 1 by the Nlrp3 and Nlrc4 inflammasomes. Journal of Immunology. 185 (6), 3127-3130 (2010).
  37. Tsuchiya, K., et al. Caspase-1 initiates apoptosis in the absence of gasdermin D. Nature Communications. 10 (1), (2019).
  38. Taabazuing, C. Y., Okondo, M. C., Bachovchin, D. A. Pyroptosis and apoptosis pathways engage in bidirectional crosstalk in monocytes and macrophages. Cell Chemical Biology. 24 (4), 507-514 (2017).
  39. Gurung, P., et al. FADD and caspase-8 mediate priming and activation of the canonical and noncanonical Nlrp3 inflammasomes. Journal of Immunology. 192 (4), 1835-1846 (2014).
  40. Man, S. M., et al. Inflammasome activation causes dual recruitment of NLRC4 and NLRP3 to the same macromolecular complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7403-7408 (2014).
  41. Man, S. M., et al. Salmonella infection induces recruitment of Caspase-8 to the inflammasome to modulate IL-1beta production. Journal of Immunology. 191 (10), 5239-5246 (2013).
  42. Van Opdenbosch, N., et al. Caspase-1 engagement and TLR-induced c-FLIP expression suppress ASC/caspase-8-dependent apoptosis by inflammasome sensors NLRP1b and NLRC4. Cell Reports. 21 (12), 3427-3444 (2017).
  43. Pierini, R., et al. AIM2/ASC triggers caspase-8-dependent apoptosis in Francisella-infected caspase-1-deficient macrophages. Cell Death & Differentiation. 19 (10), 1709-1721 (2012).
  44. Lee, S., et al. AIM2 forms a complex with pyrin and ZBP1 to drive PANoptosis and host defence. Nature. 597 (7876), 415-419 (2021).
  45. Sagulenko, V., et al. AIM2 and NLRP3 inflammasomes activate both apoptotic and pyroptotic death pathways via ASC. Cell Death & Differentiation. 20 (9), 1149-1160 (2013).
  46. Lukens, J. R., et al. Dietary modulation of the microbiome affects autoinflammatory disease. Nature. 516 (7530), 246-249 (2014).
  47. Gurung, P., Burton, A., Kanneganti, T. D. NLRP3 inflammasome plays a redundant role with caspase 8 to promote IL-1beta-mediated osteomyelitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4452-4457 (2016).
  48. Kuriakose, T., et al. ZBP1/DAI is an innate sensor of influenza virus triggering the NLRP3 inflammasome and programmed cell death pathways. Science Immunology. 1 (2), (2016).
  49. Malireddi, R. K. S., et al. TAK1 restricts spontaneous NLRP3 activation and cell death to control myeloid proliferation. Journal of Experimental Medicine. 215 (4), 1023-1034 (2018).
  50. Malireddi, R. K. S., et al. Innate immune priming in the absence of TAK1 drives RIPK1 kinase activity-independent pyroptosis, apoptosis, necroptosis, and inflammatory disease. Journal of Experimental Medicine. 217 (3), (2020).
  51. Christgen, S., et al. Identification of the PANoptosome: A molecular platform triggering pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis). Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 237 (2020).
  52. Malireddi, R. K. S., et al. RIPK1 distinctly regulates Yersinia-induced inflammatory cell death, PANoptosis. Immunohorizons. 4 (12), 789-796 (2020).
  53. Zheng, M., Karki, R., Vogel, P., Kanneganti, T. D. Caspase-6 is a key regulator of innate immunity, inflammasome activation, and host defense. Cell. 181 (3), 674-687 (2020).
  54. Karki, R., et al. ADAR1 restricts ZBP1-mediated immune response and PANoptosis to promote tumorigenesis. Cell Reports. 37 (3), 109858 (2021).
  55. Wang, Y., et al. Single cell analysis of PANoptosome cell death complexes through an expansion microscopy method. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (10), 531 (2022).
  56. Malireddi, R. K. S., et al. Inflammatory cell death, PANoptosis, mediated by cytokines in diverse cancer lineages inhibits tumor growth. Immunohorizons. 5 (7), 568-580 (2021).
  57. Kesavardhana, S., et al. The Zα2 domain of ZBP1 is a molecular switch regulating influenza-induced PANoptosis and perinatal lethality during development. Journal of Biological Chemistry. 295 (24), 8325-8330 (2020).
  58. Banoth, B., et al. ZBP1 promotes fungi-induced inflammasome activation and pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis). Journal of Biological Chemistry. 295 (52), 18276-18283 (2020).
  59. Karki, R., et al. Interferon regulatory factor 1 regulates PANoptosis to prevent colorectal cancer. JCI Insight. 5 (12), 136720 (2020).
  60. Zheng, M., et al. Impaired NLRP3 inflammasome activation/pyroptosis leads to robust inflammatory cell death via caspase-8/RIPK3 during coronavirus infection. Journal of Biological Chemistry. 295 (41), 14040-14052 (2020).
  61. Karki, R., et al. Synergism of TNF-α and IFN-γ triggers inflammatory cell death, tissue damage, and mortality in SARS-CoV-2 infection and cytokine shock syndromes. Cell. 184 (1), 149-168 (2021).
  62. Karki, R., et al. ZBP1-dependent inflammatory cell death, PANoptosis, and cytokine storm disrupt IFN therapeutic efficacy during coronavirus infection. Science Immunology. 7 (74), (2022).
  63. Jiang, W., Deng, Z., Dai, X., Zhao, W. PANoptosis: A new insight into oral infectious diseases. Frontiers in Immunology. 12, 789610 (2021).
  64. Chi, D., et al. Real-time induction of macrophage apoptosis, pyroptosis, and necroptosis by Enterococcus faecalis OG1RF and two root canal isolated strains. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 720147 (2021).
  65. Lin, J. F., et al. Phosphorylated NFS1 weakens oxaliplatin-based chemosensitivity of colorectal cancer by preventing PANoptosis. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 54 (2022).
  66. Song, M., et al. Self-assembled polymeric nanocarrier-mediated co-delivery of metformin and doxorubicin for melanoma therapy. Drug Delivery. 28 (1), 594-606 (2021).
  67. Boucher, D., Chan, A., Ross, C., Schroder, K. Quantifying caspase-1 activity in murine macrophages. Methods in Molecular Biology. 1725, 163-176 (2018).
  68. Boucher, D., Duclos, C., Denault, J. B. General in vitro caspase assay procedures. Methods in Molecular Biology. 1133, 3-39 (2014).
  69. Kaushal, V., Herzog, C., Haun, R. S., Kaushal, G. P. Caspase protocols in mice. Methods in Molecular Biology. 1133, 141-154 (2014).
  70. Swacha, P., Gekara, N. O., Erttmann, S. F. Biochemical and microscopic analysis of inflammasome complex formation. Methods in Enzymology. 625, 287-298 (2019).
  71. Talley, S., et al. A caspase-1 biosensor to monitor the progression of inflammation in vivo. Journal of Immunology. 203 (9), 2497-2507 (2019).
  72. Pelegrin, P., Barroso-Gutierrez, C., Surprenant, A. P2X7 receptor differentially couples to distinct release pathways for IL-1beta in mouse macrophage. Journal of Immunology. 180 (11), 7147-7157 (2008).
  73. Yu, J. W., et al. Cryopyrin and pyrin activate caspase-1, but not NF-kappaB, via ASC oligomerization. Cell Death & Differentiation. 13 (2), 236-249 (2006).
  74. Henry, C. M., Martin, S. J. Caspase-8 acts in a non-enzymatic role as a scaffold for assembly of a pro-inflammatory "FADDosome" complex upon TRAIL stimulation. Molecular Cell. 65 (4), 715-729 (2017).
  75. Hoffmann, E., Neumann, G., Kawaoka, Y., Hobom, G., Webster, R. G. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 6108-6113 (2000).
  76. Simpson, R. J. Homogenization of mammalian tissue. Cold Spring Harbor Protocols. (7), (2010).

Tags

Caspase ActivationInnate Immune Cell DeathDisease MechanismsTherapeutic StrategiesCell Death ProcessesBone Marrow-derived Macrophages (BMDMs)Influenza A VirusProtein CollectionSDS-PAGECaspase Lysis Buffer
check_url/it/64308?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Han, J., Tweedell, R. E., Kanneganti, T. Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death. J. Vis. Exp. (191), e64308, doi:10.3791/64308 (2023).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image