जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिका मृत्यु का आकलन करने के लिए कैसपेस सक्रियण का मूल्यांकन
Summary
यह प्रोटोकॉल इन विट्रो और विवो (चूहों में) संक्रमण, बाँझ अपमान और कैंसर के मॉडल के जवाब में कैसपेज़ सक्रियण (कैसपेज़ -1, कैसपेज़ -3, कैसपेज़ -7, कैसपेज़ -8, कैसपेज़ -9, और कैसपेज़ -11) का आकलन करने के लिए एक व्यापक विधि का वर्णन करता है ताकि कोशिका मृत्यु मार्गों की शुरुआत निर्धारित की जा सके, जैसे कि पाइरोप्टोसिस, एपोप्टोसिस, नेक्रोप्टोसिस और पीएनोप्टोसिस।
Abstract
जन्मजात प्रतिरक्षा रोगजनकों और बाँझ अपमान के जवाब में रक्षा की महत्वपूर्ण पहली पंक्ति प्रदान करती है। इस प्रतिक्रिया का एक प्रमुख यंत्रवत घटक संक्रमित या क्षतिग्रस्त कोशिकाओं को खत्म करने और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का प्रचार करने के लिए जन्मजात प्रतिरक्षा क्रमादेशित कोशिका मृत्यु (पीसीडी) की शुरुआत है। हालांकि, अतिरिक्त पीसीडी सूजन और विकृति से जुड़ा हुआ है। इसलिए, पीसीडी के सक्रियण और विनियमन को समझना जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को चिह्नित करने और रोग स्पेक्ट्रम में नए चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने का एक केंद्रीय पहलू है।
यह प्रोटोकॉल कैसपेस की निगरानी करके जन्मजात प्रतिरक्षा पीसीडी सक्रियण को चिह्नित करने के तरीके प्रदान करता है, सिस्टीन-निर्भर प्रोटीज का एक परिवार जो अक्सर एपोप्टोसिस, पाइरोप्टोसिस, नेक्रोप्टोसिस और पीएनोप्टोसिस सहित विभिन्न पीसीडी मार्गों से जुड़े होते हैं। प्रारंभिक रिपोर्टों में कैसपेज़ -2, कैसपेज़ -8, कैसपेज़ -9, और कैसपेज़ -10 को एपोप्टोसिस में प्रभावक कैसपेज़ के रूप में सर्जक कैसपेज़ और कैसपेज़ -3, कैसपेज़ -6 और कैस्पेज़ -7 के रूप में चित्रित किया गया था, जबकि बाद के अध्ययनों में भड़काऊ कैसपेस, कैसपेज़ -1, कैसपेज़ -4, कैसपेज़ -5, और कैसपेज़ -11, ड्राइव पाइरोप्टोसिस पाया गया। अब यह ज्ञात है कि पहले से परिभाषित पीसीडी मार्गों में कैसपेस और अन्य जन्मजात प्रतिरक्षा और कोशिका मृत्यु अणुओं के बीच व्यापक क्रॉसस्टॉक है, जो जन्मजात प्रतिरक्षा और पीसीडी की यांत्रिक समझ में एक महत्वपूर्ण ज्ञान अंतर की पहचान करता है और पीएनोप्टोसिस के लक्षण वर्णन की ओर जाता है। पीएनोप्टोसिस एक अद्वितीय जन्मजात प्रतिरक्षा भड़काऊ पीसीडी मार्ग है जो पीएनोप्टोसोम कॉम्प्लेक्स द्वारा विनियमित होता है, जो अन्य कोशिका मृत्यु मार्गों से कैसपेस सहित घटकों को एकीकृत करता है।
यहां, विभिन्न उत्तेजनाओं के जवाब में कैसपेस के सक्रियण का आकलन करने के तरीके प्रदान किए जाते हैं। ये विधियां इन विट्रो और विवो दोनों में पीसीडी मार्गों के लक्षण वर्णन की अनुमति देती हैं, क्योंकि सक्रिय कैसपेस प्रोटियोलिटिक दरार से गुजरते हैं जिन्हें इष्टतम एंटीबॉडी और ब्लोटिंग स्थितियों का उपयोग करके पश्चिमी सोख्ता द्वारा देखा जा सकता है। एक प्रोटोकॉल और वेस्टर्न ब्लॉटिंग वर्कफ़्लो स्थापित किया गया है जो एक ही सेलुलर आबादी से कई कैसपेस के सक्रियण के मूल्यांकन की अनुमति देता है, जो पीसीडी प्रक्रियाओं का व्यापक लक्षण वर्णन प्रदान करता है। इस पद्धति को विकास, होमियोस्टेसिस, संक्रमण, सूजन और कैंसर में अनुसंधान क्षेत्रों में लागू किया जा सकता है ताकि स्वास्थ्य और बीमारी में सेलुलर प्रक्रियाओं में पीसीडी मार्गों का मूल्यांकन किया जा सके।
Introduction
जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली संक्रमण के दौरान और बाँझ उत्तेजनाओं के जवाब में रक्षा की पहली पंक्ति के रूप में कार्य करती है, जैसे ऊतक की चोट और होमियोस्टैसिस में परिवर्तन। कोशिका की सतह और साइटोप्लाज्म में जन्मजात प्रतिरक्षा सेंसर भड़काऊ सिग्नलिंग मार्गों और सेलुलर प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर करने के लिए रोगज़नक़- या क्षति से जुड़े आणविक पैटर्न (पीएएमपी या डीएएमपी, क्रमशः) का जवाब देते हैं। जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की प्रमुख प्रक्रियाओं में से एक संक्रमित या क्षतिग्रस्त कोशिकाओं को हटाने और आगे जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को चलाने के लिए कोशिका मृत्यु का प्रेरण है। प्रोग्राम्ड सेल डेथ (पीसीडी) प्रजातियों में एक अत्यधिक संरक्षित प्रक्रिया है, जो एक जन्मजात प्रतिरक्षा तंत्र के रूप में इसके विकासवादी महत्व को उजागर करती है।
कई जन्मजात प्रतिरक्षा पीसीडी मार्ग हैं जिन्हें सभी सेल प्रकारों में सक्रिय किया जा सकता है। कैसपेस अत्यधिक संरक्षित, इंट्रासेल्युलर, सिस्टीन-निर्भर प्रोटीज का एक प्रमुख परिवार है जो कई पीसीडी मार्गों में महत्वपूर्ण हैं, जिसमें पारंपरिक रूप से गैर-भड़काऊ एपोप्टोसिस मार्ग, साथ ही भड़काऊ पीसीडी मार्ग जैसे पाइरोप्टोसिस, नेक्रोप्टोसिस और पीएनोप्टोसिस 1,2,3,4,5 शामिल हैं। . 11 मानव और 10 मुराइन कैसपेस हैं जो अच्छी तरह से परिभाषित हैं, साथ ही छद्म-कैसपेस जो कार्यात्मक हो सकते हैं, और अधिकांश को संवैधानिक रूप से निष्क्रिय मोनोमेरिक या डिमेरिक प्रो-कैसपेस के रूप में व्यक्त किया जाता है जिन्हें सक्रियण 6,7 के लिए दरार की आवश्यकता होती है। कैसपेस में मल्टीप्रोटीन कॉम्प्लेक्स की भर्ती और गठन के लिए महत्वपूर्ण डोमेन भी शामिल हैं। इनमें कैसपेज़ सक्रियण और भर्ती डोमेन (CARD) शामिल है, जो कैसपेज़ -1, कैसपेज़ -2, कैस्पेज़ -4, कैस्पेज़ -5, कैसपेज़ -9, और कैस्पेज़ -11, या डेथ एफेक्टर डोमेन (डीईडी) में पाया जा सकता है, जो कैसपेज़ -8 और कैसपेज़ -10 में पाया जाता है। उनकी प्रोटियोलिटिक गतिविधि और मल्टीप्रोटीन कॉम्प्लेक्स बनाने की उनकी क्षमता दोनों के माध्यम से, कैसपेस जन्मजात प्रतिरक्षा पीसीडी के महत्वपूर्ण चालक हैं।
जन्मजात प्रतिरक्षा पीसीडी में कैसपेस की भूमिका की पहचान पहली बार एपोप्टोसिस में की गई थी, जहां सर्जक कैसपेस, कैसपेज़ -2, कैसपेज़ -8, कैसपेज़ -9, और कैसपेज़ -10, सेल मृत्यु 8,9,10,11,12 को चलाने के लिए निष्पादनकर्ता कैसपेज़, कैसपेज़ -3, कैसपेज़ -6 और कैसपेज़ -7 को सक्रिय करते हैं। सर्जक कैसपेस को विविध सिग्नलिंग कैस्केड द्वारा सक्रिय किया जा सकता है; बाह्य मार्ग बाह्य लिगैंड-प्रेरित मृत्यु रिसेप्टर सिग्नलिंग के माध्यम से कैसपेज़ -8 को सक्रिय करता है, और आंतरिक मार्ग माइटोकॉन्ड्रियल अखंडता13 के विघटन के माध्यम से कैसपेज़ -9 को सक्रिय करता है। सक्रिय सर्जक कैसपेस अपने सक्रिय रूपों का उत्पादन करने के लिए निष्पादनकर्ता कैसपेस के बड़े और छोटे उत्प्रेरक सबयूनिट्स को अलग करने वाले लिंकर को छोड़ देते हैं। जल्लाद कैसपेस तब कोशिका को अलग करने के लिए अपने सब्सट्रेट्स को छोड़ देते हैं, जिसके परिणामस्वरूप डीएनए क्षरण, झिल्ली धब्बा, परमाणु विखंडन और एपोप्टोटिक निकायों की रिहाई14,15 होती है। यह प्रक्रिया आम तौर पर कोशिका मृत्यु के एक गैर-लिटिक और गैर-भड़काऊ रूप में समाप्त होती है जब एफेरोसाइटोसिस 16 द्वारा मरने वाली कोशिकाओं की तत्काल निकासी के साथ युग्मितहोती है। हालांकि, एफेरोसाइटोसिस में दोष या फागोसाइटिक कोशिकाओं की कमी से एपोप्टोटिक कोशिकाओं का संचय हो सकता है, जो तब लिटिक और भड़काऊ कोशिका मृत्यु से गुजरते हैं 17,18.
कैसपेज़ -1 (मानव और माउस), कैसपेज़ -4 और कैसपेज़ -5 (मानव), और कैसपेज़ -11 (माउस) सहित भड़काऊ कैसपेस को भड़काऊ जन्मजात प्रतिरक्षा पीसीडी (III-पीसीडी) के एक रूप के दौरान सक्रिय होने की खोज की गई है जिसे पाइरोप्टोसिस कहा जाता है। कैसपेज़ -1 सक्रियण ज्वलनशीलता के गठन से जुड़ा हुआ है, जो मल्टीप्रोटीन कॉम्प्लेक्स हैं जिनमें साइटोसोलिक जन्मजात प्रतिरक्षा सेंसर, एक एडाप्टर अणु (एपोप्टोसिस से जुड़े धब्बे जैसे प्रोटीन जिसमें कार्ड [एएससी]), और कैसपेज़ -1 शामिल हैं। इस परिसर का गठन कैसपेज़ -1 को अपने सक्रिय रूप को जारी करने के लिए निकटता-मध्यस्थता ऑटोप्रोटियोलिसिस से गुजरने की अनुमति देता है, जो प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स इंटरल्यूकिन (आईएल) -1 और आईएल -18 और छिद्र बनाने वाले अणु गैसडरमिन डी (जीएसडीएमडी) 19,20,21,22,23 सहित लक्ष्य सब्सट्रेट्स को छोड़ सकता है। . कैसपेज़ -11, कैसपेज़ -4, और कैसपेज़ -5 भी लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस) 19,20 जैसे पीएएमपी को महसूस करने के बाद ज्वलनशील के अपस्ट्रीम गठन के बिना जीएसडीएमडी को सक्रिय कर सकते हैं। ये कैसपेस साइटोसोलिक एलपीएस से जुड़ने पर सक्रियण के लिए ऑलिगोमेराइजेशन और आत्म-दरार से गुजरते हैं, जो आईएल -1 और आईएल -18 परिपक्वता 20 को प्रेरित करने के लिए सेल-आंतरिक तरीके से गैर-कैनोनिकल ज्वलनशील सक्रियण 24,25,26 और कैसपेज़ -1 सक्रियण की ओर जाता है। इन प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स की परिपक्वता और रिहाई इन कैसपेस को “भड़काऊ” के रूप में चिह्नित करती है। इसके अतिरिक्त, एपोप्टोटिक कैसपेज़ -8 को ज्वलनशीलता के लिए स्थानीयकृत पाया गया है, जो एपोप्टोटिक और पाइरोप्टोटिक प्रक्रियाओं के बीच एक लिंक प्रदान करता है। अध्ययनों में पाया गया है कि एपोप्टोटिक कैसपेस -8 पीसीडी के एक अन्य रूप को विनियमित करने के लिए भी महत्वपूर्ण है जिसे नेक्रोप्टोसिस कहा जाता है। कैसपेज़ -8 के नुकसान के परिणामस्वरूप नेक्रोप्टोसिस 27,28,29,30,31,32,33,34,35 के III-PCD मार्ग को चलाने के लिए सहज रिसेप्टर-इंटरैक्टिंग सेरीन-थ्रेओनिन किनेज 3 (RIPK3)-मध्यस्थता मिश्रित वंश किनेज डोमेन-जैसे स्यूडोकाइनेज (MLKL) सक्रियण होता है।
जबकि कैस्पेस को ऐतिहासिक रूप से “एपोप्टोटिक” या “भड़काऊ” के रूप में वर्गीकृत किया गया है, जो उनके द्वारा शुरू की जाने वाली कोशिका मृत्यु के प्रकार पर आधारित है, बढ़ते सबूत बताते हैं कि कैसपेस 3,4 के माध्यम से जन्मजात प्रतिरक्षा पीसीडी मार्गों के बीच व्यापक क्रॉसस्टॉक है। उदाहरण के लिए, ज्वलनशीलता से भड़काऊ कैसपेज़ -1 अपने कैननिकल सक्रियण साइट34 पर एपोप्टोटिक कैसपेज़ -7 को छोड़ देता है। कैसपेज़ -1 सक्रियण से पॉली (एडीपी-राइबोज) पोलीमरेज़ 1 (पीएआरपी 1)36 जैसे एपोप्टोटिक सब्सट्रेट्स की दरार भी हो सकती है। जीएसडीएमडी की कमी वाली कोशिकाओं में, कैसपेज़ -1 कैसपेज़ -337,38 को भी छोड़ सकता है। इसके अतिरिक्त, कैनोनिकल एपोप्टोटिक कैसपेस -3 पीसीडी17,18 को प्रेरित करने के लिए गैसडर्मिन ई (जीएसडीएमई) को छोड़ सकता है और जीएसडीएमडी को निष्क्रिय रूप40 में भी संसाधित कर सकता है। इसके अलावा, ज्वलनशील परिसर में कैसपेज़ -8 भर्ती 39,40,41,42,43,44,45 देखी गई है, और कैसपेज़ -8 कैननिकल और नॉनकैनोनिकल ज्वलनशील सक्रियण39 का एक प्रमुख नियामक है। कई भड़काऊ स्थितियों में कैसपेज़ -8 और कैसपेज़ -1 के लिए अतिव्यापी और अनावश्यक भूमिकाएं भी हैं, और जन्मजात प्रतिरक्षा पीसीडी रोग स्पेक्ट्रम 39,46,47,48,49,50 में पाइरोप्टोटिक, एपोप्टोटिक और नेक्रोप्टोटिक घटकों के सक्रियण की विशेषता है।
भड़काऊ और एपोप्टोटिक कैसपेस के बीच इस क्रॉसटॉक के आधार पर, जन्मजात प्रतिरक्षा और पीसीडी की यांत्रिक समझ में एक महत्वपूर्ण अंतर की पहचान की गई, जिससे पैनोप्टोसिस की खोज हुई। पीएनोप्टोसिस III-PCD का एक अनूठा रूप है जो रोगजनकों, PAMPs, DAMPs और होमोस्टेसिस में परिवर्तन के जवाब में सक्रिय होता है और PANoptosomes द्वारा विनियमित होता है – बहुआयामी मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स जो अन्य कोशिका मृत्यु मार्गों 44,50,51,52,53,54,55 से घटकों को एकीकृत करते हैं . पीएनोप्टोसिस में जैविक प्रभावों की समग्रता को व्यक्तिगत रूप सेअकेले पाइरोप्टोसिस, एपोप्टोसिस, या नेक्रोप्टोसिस द्वारा जिम्मेदार नहीं ठहराया जा सकता है 3,4,35,36,39,46,47,48, क्योंकि पैनोप्टोसिस को कैसपेज़ -1, कैसपेज़ -11, कैस्पेज़ -8, कैसपेज़ -9, कैस्पेस -3, और / या कैसपेज़ -7 सहित कई कैसपेस के सक्रियण की विशेषता है। संदर्भ के आधार पर 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 . पीएनोप्टोसिस को संक्रामक और भड़काऊ रोगों के साथ-साथ कैंसर और कैंसरउपचारों में तेजी से फंसाया गया है 3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 , 54,56
57,58,59,60,61,62,63,64,65,66.
एपोप्टोसिस, पाइरोप्टोसिस, नेक्रोप्टोसिस और पीएनोपोसिस सहित कोशिका मृत्यु मार्गों में कैसपेस की आवश्यक भूमिका को देखते हुए, उनके सक्रियण को चिह्नित करने और पीसीडी मार्गों की पूरी जटिलता को समझने के लिए तकनीकविकसित करना महत्वपूर्ण है। यहां प्रोटोकॉल कोशिकाओं को उत्तेजित करने और कैसपेस के बाद के सक्रियण को मापने के लिए एक विधि का विवरण देता है (चित्रा 1)। यह विधि कैसपेस के प्रोटियोलिटिक दरार का लाभ उठाती है, जो आम तौर पर उनके सक्रियण के लिए आवश्यक होती है, उनका अध्ययन करने के साधन के रूप में। पश्चिमी सोख्ता के माध्यम से, प्रोटीन के आकार को निर्धारित किया जा सकता है, जिससे निष्क्रिय प्रो-कैसपेस और उनके सक्रिय, क्लीवर रूपों के स्पष्ट विज़ुअलाइज़ेशन और भेदभाव की अनुमति मिलती है।
इस प्रोटोकॉल के प्रमुख लाभ हैं 1) पीसीडी सक्रियण को अधिक सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए अंतर्जात कोशिकाओं की एक आबादी से समानांतर में कई कैसपेस के सक्रियण का आकलन करने की इसकी क्षमता और 2) अपेक्षाकृत सरल प्रयोगशाला तकनीकों का उपयोग जिन्हें व्यापक प्रशिक्षण या महंगे उपकरणों की आवश्यकता नहीं होती है। पिछले प्रोटोकॉल ने कल्चर सुपरनैटेंट, सेल और ऊतक लाइसेट, माइक्रोस्कोपी के माध्यम से पूरी कोशिकाओं और विवो 67,68,69,70,71 में कैसपेज़ सक्रियण की निगरानी के लिए पश्चिमी सोख्ता, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर या एंटीबॉडी स्टेनिंग का उपयोग किया है, लेकिन ये तकनीक आम तौर पर एक नमूने में केवल एक या दो कैसपेस की निगरानी करती हैं। इसके अलावा, जबकि दरार पर फ्लोरेस वाले कैसपेज़ क्लीवेज साइटों वाले सिंथेटिक पेप्टाइड सब्सट्रेट्स का उपयोग सेल या ऊतक लाइसेट69 में कैसपेज़ सक्रियण की निगरानी के लिए किया गया है, इन सब्सट्रेट्स को अक्सर एक से अधिक कैसपेज़ द्वारा छोड़ा जा सकता है, जिससे इस प्रणाली में व्यक्तिगत कैसपेस के विशिष्ट सक्रियण को निर्धारित करना मुश्किल हो जाता है। इसके अतिरिक्त, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर या अन्य टैग-आधारित विधियों के उपयोग के बजाय पश्चिमी सोख्ता का उपयोग शोधकर्ताओं को रिपोर्टर जीन के साथ विशिष्ट सेल लाइनें बनाने के बजाय अंतर्जात कोशिकाओं का उपयोग करने की अनुमति देता है। अंतर्जात कोशिकाओं का उपयोग करने के कई फायदे हैं, जिसमें यह तथ्य भी शामिल है कि कई अमर सेल लाइनों में प्रमुख सेल डेथ अणुओं72,73 की कमी है, जो परिणामों को प्रभावित कर सकती है। इसके अतिरिक्त, अंतर्जात कोशिकाओं का उपयोग करने से एकल वंश के बजाय मैक्रोफेज, उपकला कोशिकाओं और एंडोथेलियल कोशिकाओं जैसे विभिन्न सेल प्रकारों के मूल्यांकन की अनुमति मिलती है। वेस्टर्न ब्लॉटिंग भी एक अपेक्षाकृत सरल और लागत प्रभावी तकनीक है जिसे बड़े, महंगे उपकरण या जटिल सेटअप की आवश्यकता के बिना दुनिया भर की प्रयोगशालाओं में किया जा सकता है।
यह प्रोटोकॉल जीव विज्ञान में व्यापक रूप से कैसपेस के कोशिका मृत्यु-निर्भर और कोशिका मृत्यु-स्वतंत्र कार्यों दोनों को समझने के लिए लागू होता है, जिसमें उनकी मचान भूमिकाएं और अन्य भड़काऊ सिग्नलिंगमार्गों में कार्य शामिल हैं। इस पद्धति को लागू करने से जन्मजात प्रतिरक्षा पीसीडी मार्गों और बीमारियों और स्थितियों में भड़काऊ सिग्नलिंग के अध्ययन में एक एकीकृत दृष्टिकोण की अनुमति मिलती है, और इस प्रोटोकॉल का उपयोग महत्वपूर्ण नियामक प्रक्रियाओं और यांत्रिक कनेक्शनों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जो भविष्य की चिकित्सीय रणनीतियों के विकास को सूचित करेंगे।
Protocol
Representative Results
Discussion
कैसपेस दरार और सक्रियण की निगरानी जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के हिस्से के रूप में जन्मजात प्रतिरक्षा पीसीडी सक्रियण की सबसे व्यापक तस्वीरों में से एक प्रदान करती है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल आईएव…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम अपनी टिप्पणियों और सुझावों के लिए कन्नेगंती प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं, और हम वैज्ञानिक संपादन समर्थन के लिए जे गुललेट, पीएचडी को धन्यवाद देते हैं। हमारी प्रयोगशाला में काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) द्वारा समर्थित है एआई 101935, एआई 124346, एआई 160179, एआर 056296, और सीए 253095 (टी-डीके को) और अमेरिकी लेबनानी सीरियाई एसोसिएटेड चैरिटीज (टी-डीके को)। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करती है।
Materials
| 0.45 μm filter | Millipore | SCHVU05RE | |
| 10 mL syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| 12% polyacrylamide gel with 10 wells | Bio-Rad | 4561043 | |
| 12-well plate | Corning | 07-200-82 | |
| 18 G needle | BD Biosciences | 305195 | |
| 25 G needle | BD Biosciences | 305122 | |
| 50 mL tube | Fisher Scientific | 50-809-218 | |
| 70 μm cell strainer | Corning | 431751 | |
| 150 mm tissue culture dishes | Corning | 430597 | |
| 182-cm2 tissue culture flask | Genesee Scientific | 25-211 | |
| Accessory white trans tray | Cytiva | 29-0834-18 | |
| Anti–caspase-1 antibody | AdipoGen | AG-20B-0042-C100 | |
| Anti–caspase-11 antibody | Novus Biologicals | NB120-10454 | |
| Anti–caspase-3 antibody | Cell Signaling Technology | 9662 | |
| Anti–caspase-7 antibody | Cell Signaling Technology | 9492 | |
| Anti–caspase-8 antibody | Cell Signaling Technology | 4927 | |
| Anti–caspase-9 antibody | Cell Signaling Technology | 9504 | |
| Anti–cleaved caspase-3 antibody | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| Anti–cleaved caspase-7 antibody | Cell Signaling Technology | 9491 | |
| Anti–cleaved caspase-8 antibody | Cell Signaling Technology | 8592 | |
| Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 315-035-047 | |
| Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-047 | |
| Anti-rat HRP-conjugated secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 112-035-003 | |
| Anti–β-Actin antibody (C4) HRP | Santa Cruz | sc-47778 HRP | |
| ATP | InvivoGen | tlrl-atpl | |
| BBL Trypticase Soy Broth | BD Biosciences | 211768 | |
| Bead bath | Chemglass Life Sciences | CLS-4598-009 | |
| Biophotometer D30 | Eppendorf | 6133000010 | |
| BME | Sigma | M6250 | |
| Bromophenol blue | Sigma | BO126 | |
| Cell scrapers | CellTreat Scientific Products | 229315 | |
| Chemiluminescence imager (Amersham 600) | Cytiva | 29083461 | |
| CO2 chamber | VetEquip | 901703 | |
| Cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-129 | |
| Dissecting scissors | Thermo Fisher Scientific | 221S | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995-073 | |
| DTT | Sigma | 43815 | |
| Eelectrophoresis apparatus | Bio-Rad | 1658004 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1620 | |
| Filter paper | Bio-Rad | 1703965 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Francisella novicida (U112 strain) | BEI Resources | NR-13 | |
| Gel releaser | Bio-Rad | 1653320 | |
| Gentamycin | Gibco | 15750060 | |
| Glycerol | Sigma | G7893 | |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| HCl | Sigma | H9892 | |
| Heat block | Fisher Scientific | 23-043-160 | |
| Herpes simplex virus 1 (HF strain) | ATCC | VR-260 | |
| High glucose DMEM | Sigma | D6171 | |
| Human anti–caspase-1 antibody | R&D Systems | MAB6215 | |
| Human anti–caspase-8 antibody | Enzo | ALX-804-242 | |
| Humidified incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026282 | |
| Image analysis software | ImageJ | v1.53a | |
| IMDM | Thermo Fisher Scientific | 12440-053 | |
| Influenza A virus (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8]) | constructed per Hoffmann et al. | ||
| L929 cells | ATCC | CCL-1 | cell line for creating L929-conditioned media |
| L-cysteine | Thermo Fisher Scientific | BP376-100 | |
| Luminata Forte Western HRP substrate | Millipore | WBLUF0500 | standard-sensitivity HRP substrate |
| MDCK cells | ATCC | CCL-34 | cell line for determining IAV viral titer |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002401 | |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| Nonfat dried milk powder | Kroger | ||
| NP-40 solution | Sigma | 492016 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Penicillin and streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 07-202-011 | |
| PhosSTOP | Roche | PHOSS-RO | |
| Power source | Bio-Rad | 164-5052 | |
| Protease inhibitor tablet | Sigma | S8820 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Rocking shaker | Labnet | S2035-E | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 72068 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Square Petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Stripping buffer | Thermo Fisher Scientific | 21059 | |
| Super Signal Femto HRP substrate | Thermo Fisher Scientific | 34580 | high-sensitivity HRP substrate |
| Tabletop centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004524 | |
| Trans-Blot semi-dry system | Bio-Rad | 170-3940 | |
| Tris | Sigma | TRIS-RO | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Ultrapure lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 | InvivoGen | tlrl-3pelps | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 | cell line for determining HSV1 viral titer |
Riferimenti
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- Gullett, J. M., Tweedell, R. E., Kanneganti, T. D. It’s all in the PAN: Crosstalk, plasticity, redundancies, switches, and interconnectedness encompassed by PANoptosis underlying the totality of cell death-associated biological effects. Cells. 11 (9), 1495 (2022).
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