Detta protokoll beskriver en omfattande metod för att bedöma kaspasaktivering (kaspas-1, kaspas-3, kaspas-7, kaspas-8, kaspas-9 och kaspas-11) som svar på både in vitro – och in vivo (hos möss) modeller av infektion, sterila förolämpningar och cancer för att bestämma initieringen av celldödsvägar, såsom pyroptos, apoptos, nekrotos och PANoptos.
Medfödd immunitet ger den kritiska första försvarslinjen som svar på patogener och sterila förolämpningar. En viktig mekanistisk komponent i detta svar är initieringen av medfödd immunprogrammerad celldöd (PCD) för att eliminera infekterade eller skadade celler och sprida immunsvar. Överskott av PCD är emellertid förknippat med inflammation och patologi. Att förstå aktivering och reglering av PCD är därför en central aspekt för att karakterisera medfödda immunsvar och identifiera nya terapeutiska mål över sjukdomsspektrumet.
Detta protokoll tillhandahåller metoder för att karakterisera medfödd immun-PCD-aktivering genom att övervaka kaspaser, en familj av cysteinberoende proteaser som ofta är associerade med olika PCD-vägar, inklusive apoptos, pyroptos, nekrotos och PAN-optos. Initiala rapporter karakteriserade kaspas-2, kaspas-8, kaspas-9 och kaspas-10 som initiatorkaser och kaspas-3, kaspas-6 och kaspas-7 som effektorkaspaser vid apoptos, medan senare studier fann att inflammatoriska kaspaser, kaspas-1, kaspas-4, kaspas-5 och kaspas-11, driver pyroptos. Det är nu känt att det finns omfattande överhörning mellan kaspaser och andra medfödda immun- och celldödsmolekyler över de tidigare definierade PCD-vägarna, vilket identifierar en viktig kunskapslucka i den mekanistiska förståelsen av medfödd immunitet och PCD och leder till karakterisering av PANoptos. PANoptos är en unik medfödd immuninflammatorisk PCD-väg som regleras av PANoptosom-komplex, som integrerar komponenter, inklusive kaspaser, från andra celldödsvägar.
Här tillhandahålls metoder för att bedöma aktiveringen av kaspaser som svar på olika stimuli. Dessa metoder möjliggör karakterisering av PCD-vägar både in vitro och in vivo, eftersom aktiverade kaspaser genomgår proteolytisk klyvning som kan visualiseras genom western blotting med optimala antikroppar och blottningsförhållanden. Ett protokoll och western blotting workflow har upprättats som möjliggör bedömning av aktivering av flera kaspaser från samma cellulära population, vilket ger en omfattande karakterisering av PCD-processerna. Denna metod kan tillämpas över forskningsområden inom utveckling, homeostas, infektion, inflammation och cancer för att utvärdera PCD-vägar genom cellulära processer inom hälsa och sjukdom.
Det medfödda immunsystemet fungerar som den första försvarslinjen under infektion och som svar på sterila stimuli, såsom vävnadsskada och förändringar i homeostas. Medfödda immunsensorer på cellytan och i cytoplasman svarar på patogen- eller skadeassocierade molekylära mönster (PAMPs respektive DAMPs) för att utlösa inflammatoriska signalvägar och cellulära svar. En av nyckelprocesserna för det medfödda immunsvaret är induktionen av celldöd för att avlägsna infekterade eller skadade celler och driva ytterligare medfödda och adaptiva immunsvar. Programmerad celldöd (PCD) är en mycket bevarad process över arter, vilket belyser dess evolutionära betydelse som en medfödd immunmekanism.
Det finns flera medfödda immun-PCD-vägar som kan aktiveras i alla celltyper. Caspaser är en nyckelfamilj av högbevarade, intracellulära, cysteinberoende proteaser som är kritiska över många PCD-vägar, inklusive den traditionellt icke-inflammatoriska apoptosvägen, liksom inflammatoriska PCD-vägar såsom pyroptos, nekrotos och PANoptos 1,2,3,4,5 . Det finns 11 humana och 10 murina kaspaser som är väldefinierade, liksom pseudokaspaser som kan vara funktionella, och de flesta uttrycks konstitutivt som inaktiva monomera eller dimera pro-kaspaser som kräver klyvning för aktivering 6,7. Caspases innehåller också viktiga domäner för rekrytering och bildning av multiproteinkomplex. Dessa inkluderar caspase activation and recruitment domain (CARD), som finns i caspase-1, caspase-2, caspase-4, caspase-5, caspase-9 och caspase-11, eller death effector domain (DED), som finns i caspase-8 och caspase-10. Genom både deras proteolytiska aktivitet och deras förmåga att bilda multiproteinkomplex är kaspaser kritiska drivkrafter för medfödd immun-PCD.
Kaspasernas roll i medfödd immun-PCD identifierades först vid apoptos, där initiatorns kaspaser, caspase-2, caspase-8, caspase-9 och caspase-10, aktiverar bödelkaspaser, caspase-3, caspase-6 och caspase-7, för att driva celldöd 8,9,10,11,12. Initiatorkaspaser kan aktiveras av olika signalkaskader; Den yttre vägen aktiverar kaspas-8 genom extracellulär ligandinducerad dödsreceptorsignalering, och den inneboende vägen aktiverar kaspas-9 genom störning av mitokondriell integritet13. Aktiverade initiatorkaspaser klyver länkaren som separerar de stora och små katalytiska underenheterna av bödelkaspaser för att producera sina aktiva former. Bödelns kaspaser klyver sedan sina substrat för att demontera cellen, vilket resulterar i DNA-nedbrytning, membranblåsning, kärnfragmentering och frisättning av apoptotiska kroppar14,15. Denna process slutar vanligtvis i en icke-lytisk och icke-inflammatorisk form av celldöd när den kombineras med omedelbar rensning av de döende cellerna genom efferocytos16. Defekter i efferocytos eller brist på fagocytiska celler kan emellertid leda till ackumulering av apoptotiska celler, som sedan genomgår lytisk och inflammatorisk celldöd17,18.
De inflammatoriska kaspaserna, inklusive kaspas-1 (människa och mus), kaspas-4 och kaspas-5 (människa) och kaspas-11 (mus), har upptäckts aktiveras under en form av inflammatorisk medfödd immun-PCD (III-PCD) som kallas pyroptos. Kaspas-1-aktivering är associerad med bildandet av inflammasomer, vilka är multiproteinkomplex innehållande en cytosolisk medfödd immunsensor, en adaptermolekyl (apoptosassocierat fläckliknande protein innehållande ett CARD [ASC]) och kaspas-1. Bildningen av detta komplex tillåter kaspas-1 att genomgå närhetsmedierad autoproteolys för att frigöra sin aktiva form, vilket kan klyva målsubstrat inklusive de proinflammatoriska cytokinerna interleukin (IL) -1β och IL-18 och den porbildande molekylen gasdermin D (GSDMD) 19,20,21,22,23 . Kaspas-11, kaspas-4 och kaspas-5 kan också aktivera GSDMD utan uppströmsbildning av inflammasomen efter avkänning av PAMPs såsom lipopolysackarid (LPS)19,20. Dessa kaspaser genomgår dimerisering följt av oligomerisering och självklyvning för aktivering vid bindning till cytosolisk LPS, vilket leder till icke-kanonisk inflammasomaktivering 24,25,26 och kaspas-1-aktivering på ett cellinneboende sätt för att inducera IL-1β och IL-18-mognad 20. Mognaden och frisättningen av dessa proinflammatoriska cytokiner karakteriserar dessa kaspaser som “inflammatoriska”. Dessutom har den apoptotiska kaspas-8 visat sig lokaliseras till inflammasomen, vilket ger en länk mellan apoptotiska och pyroptotiska processer. Studier har visat att den apoptotiska kaspas-8 också är avgörande för att reglera en annan form av PCD som kallas nekrotros. Förlusten av kaspas-8 resulterar i spontan receptorinteragerande serin-treoninkinas 3 (RIPK3)-medierad blandad härstamningskinas domänliknande pseudokinas (MLKL) aktivering för att driva III-PCD-vägen för nekroptos 27,28,29,30,31,32,33,34,35.
Medan kaspaser historiskt har klassificerats som “apoptotiska” eller “inflammatoriska” baserat på vilken typ av celldöd de initierar, tyder växande bevis på att det finns omfattande överhörning mellan de medfödda immun-PCD-vägarna genom kaspaser 3,4. Till exempel klyver den inflammatoriska kaspas-1 från inflammasomer den apoptotiska kaspas-7 vid dess kanoniska aktiveringsställe34. Kaspas-1-aktivering kan också leda till klyvning av apoptotiska substrat såsom poly(ADP-ribos) polymeras 1 (PARP1)36. I celler som saknar GSDMD kan kaspas-1 också klyva kaspas-337,38. Dessutom kan den kanoniskt apoptotiska kaspas-3 klyva gasdermin E (GSDME) för att inducera PCD17,18 och bearbetar också GSDMD till en inaktiv form40. Vidare har kaspas-8-rekrytering till inflammasomkomplexet observerats 39,40,41,42,43,44,45, och kaspas-8 är en nyckelregulator för kanonisk och icke-kanonisk inflammasomaktivering 39. Det finns också överlappande och redundanta roller för kaspas-8 och kaspas-1 vid många inflammatoriska tillstånd, och medfödd immun-PCD som kännetecknas av aktivering av pyroptotiska, apoptotiska och nekrototiska komponenter förekommer över sjukdomsspektrumet 39,46,47,48,49,50.
Baserat på denna överhörning mellan inflammatoriska och apoptotiska kaspaser identifierades en viktig lucka i den mekanistiska förståelsen av medfödd immunitet och PCD, vilket ledde till upptäckten av PANoptos. PANoptos är en unik form av III-PCD som aktiveras som svar på patogener, PAMPs, DAMPs och förändringar i homeostas och regleras av PANoptosomer – mångfacetterade makromolekylära komplex som integrerar komponenter från andra celldödsvägar 44,50,51,52,53,54,55 . De totala biologiska effekterna vid PANoptos kan inte enskilt förklaras av pyroptos, apoptos eller nekroptos enbart 3,4,35,36,39,46,47,48, eftersom PANoptos kännetecknas av aktivering av multipla kaspaser, inklusive kaspas-1, kaspas-11, kaspas-8, kaspas-9, kaspas-3 och/eller kaspas-7, beroende på sammanhanget: 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 . PANoptos har blivit alltmer inblandad i infektiösa och inflammatoriska sjukdomar, liksom i cancer och cancerterapier 3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 ,54,56
,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66.
Med tanke på den viktiga rollen av kaspaser över celldödsvägar, inklusive i apoptos, pyroptos, nekrotos och PANoptos, är det viktigt att utveckla tekniker för att karakterisera deras aktivering och förstå PCD-vägarnas fulla komplexitet. Protokollet här beskriver en metod för att stimulera celler och mäta efterföljande aktivering av kaspaser (figur 1). Denna metod utnyttjar den proteolytiska klyvningen av kaspaser, som i allmänhet krävs för deras aktivering, som ett sätt att studera dem. Genom western blotting kan proteinstorlekarna bestämmas, vilket möjliggör tydlig visualisering och differentiering av inaktiva pro-kaspaser och deras aktiverade, klyvda former.
De största fördelarna med detta protokoll är 1) dess förmåga att bedöma aktiveringen av flera kaspaser parallellt från en enda population av endogena celler för att mer exakt bestämma PCD-aktivering och 2) användningen av relativt enkla laboratorietekniker som inte kräver omfattande utbildning eller dyr utrustning. Tidigare protokoll har använt western blotting, fluorescerande reportrar eller antikroppsfärgning för att övervaka kaspasaktivering i odlingssupernatanter, cell- och vävnadslysater, hela celler via mikroskopi och in vivo 67,68,69,70,71, men dessa tekniker övervakar i allmänhet bara en eller två kaspaser i ett prov. Dessutom, medan syntetiska peptidsubstrat innehållande kaspasklyvningsställen som fluorescerar vid klyvning har använts för att övervaka kaspasaktivering i cell- eller vävnadslysat69, kan dessa substrat ofta klyvas av mer än en kaspas, vilket gör det svårt att bestämma den specifika aktiveringen av enskilda kaspaser i detta system. Dessutom tillåter användningen av västerländsk blotting snarare än användningen av fluorescerande reportrar eller andra taggbaserade metoder forskare att använda endogena celler snarare än att skapa specifika cellinjer med reportergener. Det finns flera fördelar med att använda endogena celler, inklusive det faktum att många odödliga cellinjer har brist på nyckelcelldödsmolekyler72,73, vilket kan påverka resultaten. Dessutom möjliggör användning av endogena celler utvärdering av olika celltyper, såsom makrofager, epitelceller och endotelceller, snarare än en enda härstamning. Western blotting är också en relativt enkel och kostnadseffektiv teknik som kan utföras i laboratorier runt om i världen utan behov av stor, dyr utrustning eller komplicerade inställningar.
Detta protokoll är allmänt tillämpligt över biologi för att förstå både celldödsberoende och celldödsoberoende funktioner hos caspaser, inklusive deras byggnadsställningsroller och funktioner i andra inflammatoriska signalvägar74. Att tillämpa denna metod möjliggör ett enhetligt tillvägagångssätt i studien av medfödda immun-PCD-vägar och inflammatorisk signalering över sjukdomar och tillstånd, och detta protokoll kan användas för att identifiera kritiska regleringsprocesser och mekanistiska kopplingar som kommer att informera utvecklingen av framtida terapeutiska strategier.
Övervakning av kaspasklyvning och aktivering ger en av de mest omfattande bilderna av medfödd immun-PCD-aktivering som en del av det medfödda immunsvaret. Protokollet som beskrivs här visar en strategi för att övervaka kaspasaktivering som svar på IAV-, HSV1- och F. novicida-infektioner och den sterila utlösaren LPS + ATP, men många andra stimuli kan inducera PCD och kan användas i denna metod, vilket har visats i flera publikationer 44,48,49,50,51,52,53,54,56<…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar medlemmarna i Kanneganti-labbet för deras kommentarer och förslag, och vi tackar J. Gullett, PhD, för vetenskapligt redigeringsstöd. Arbetet i vårt laboratorium stöds av National Institutes of Health (NIH) bidrag AI101935, AI124346, AI160179, AR056296 och CA253095 (till T.-D.K.) och av American Lebanese Syrian Associated Charities (till T.-D.K.). Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institutes of Health.
0.45 μm filter | Millipore | SCHVU05RE | |
10 mL syringe | BD Biosciences | 309604 | |
12% polyacrylamide gel with 10 wells | Bio-Rad | 4561043 | |
12-well plate | Corning | 07-200-82 | |
18 G needle | BD Biosciences | 305195 | |
25 G needle | BD Biosciences | 305122 | |
50 mL tube | Fisher Scientific | 50-809-218 | |
70 μm cell strainer | Corning | 431751 | |
150 mm tissue culture dishes | Corning | 430597 | |
182-cm2 tissue culture flask | Genesee Scientific | 25-211 | |
Accessory white trans tray | Cytiva | 29-0834-18 | |
Anti–caspase-1 antibody | AdipoGen | AG-20B-0042-C100 | |
Anti–caspase-11 antibody | Novus Biologicals | NB120-10454 | |
Anti–caspase-3 antibody | Cell Signaling Technology | 9662 | |
Anti–caspase-7 antibody | Cell Signaling Technology | 9492 | |
Anti–caspase-8 antibody | Cell Signaling Technology | 4927 | |
Anti–caspase-9 antibody | Cell Signaling Technology | 9504 | |
Anti–cleaved caspase-3 antibody | Cell Signaling Technology | 9661 | |
Anti–cleaved caspase-7 antibody | Cell Signaling Technology | 9491 | |
Anti–cleaved caspase-8 antibody | Cell Signaling Technology | 8592 | |
Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 315-035-047 | |
Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-047 | |
Anti-rat HRP-conjugated secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 112-035-003 | |
Anti–β-Actin antibody (C4) HRP | Santa Cruz | sc-47778 HRP | |
ATP | InvivoGen | tlrl-atpl | |
BBL Trypticase Soy Broth | BD Biosciences | 211768 | |
Bead bath | Chemglass Life Sciences | CLS-4598-009 | |
Biophotometer D30 | Eppendorf | 6133000010 | |
BME | Sigma | M6250 | |
Bromophenol blue | Sigma | BO126 | |
Cell scrapers | CellTreat Scientific Products | 229315 | |
Chemiluminescence imager (Amersham 600) | Cytiva | 29083461 | |
CO2 chamber | VetEquip | 901703 | |
Cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-129 | |
Dissecting scissors | Thermo Fisher Scientific | 221S | |
DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995-073 | |
DTT | Sigma | 43815 | |
Eelectrophoresis apparatus | Bio-Rad | 1658004 | |
Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
Fetal bovine serum | Biowest | S1620 | |
Filter paper | Bio-Rad | 1703965 | |
Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
Francisella novicida (U112 strain) | BEI Resources | NR-13 | |
Gel releaser | Bio-Rad | 1653320 | |
Gentamycin | Gibco | 15750060 | |
Glycerol | Sigma | G7893 | |
Glycine | Sigma | G8898 | |
HCl | Sigma | H9892 | |
Heat block | Fisher Scientific | 23-043-160 | |
Herpes simplex virus 1 (HF strain) | ATCC | VR-260 | |
High glucose DMEM | Sigma | D6171 | |
Human anti–caspase-1 antibody | R&D Systems | MAB6215 | |
Human anti–caspase-8 antibody | Enzo | ALX-804-242 | |
Humidified incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026282 | |
Image analysis software | ImageJ | v1.53a | |
IMDM | Thermo Fisher Scientific | 12440-053 | |
Influenza A virus (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8]) | constructed per Hoffmann et al. | ||
L929 cells | ATCC | CCL-1 | cell line for creating L929-conditioned media |
L-cysteine | Thermo Fisher Scientific | BP376-100 | |
Luminata Forte Western HRP substrate | Millipore | WBLUF0500 | standard-sensitivity HRP substrate |
MDCK cells | ATCC | CCL-34 | cell line for determining IAV viral titer |
Methanol | Sigma | 322415 | |
Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002401 | |
Non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
Nonfat dried milk powder | Kroger | ||
NP-40 solution | Sigma | 492016 | |
PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
Penicillin and streptomycin | Sigma | P4333 | |
Petri dish | Fisher Scientific | 07-202-011 | |
PhosSTOP | Roche | PHOSS-RO | |
Power source | Bio-Rad | 164-5052 | |
Protease inhibitor tablet | Sigma | S8820 | |
PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
Rocking shaker | Labnet | S2035-E | |
SDS | Sigma | L3771 | |
Sodium chloride | Sigma | S9888 | |
Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
Sodium hydroxide | Sigma | 72068 | |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
Square Petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
Stripping buffer | Thermo Fisher Scientific | 21059 | |
Super Signal Femto HRP substrate | Thermo Fisher Scientific | 34580 | high-sensitivity HRP substrate |
Tabletop centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004524 | |
Trans-Blot semi-dry system | Bio-Rad | 170-3940 | |
Tris | Sigma | TRIS-RO | |
Tween 20 | Sigma | P1379 | |
Ultrapure lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 | InvivoGen | tlrl-3pelps | |
Vero cells | ATCC | CCL-81 | cell line for determining HSV1 viral titer |