Isolement fécal murin et transplantation de microbiote
Summary
L’objectif ici est de définir un protocole pour étudier les mécanismes de la dysbiose dans les maladies cardiovasculaires. Cet article explique comment collecter et transplanter de manière aseptique des échantillons fécaux murins, isoler les intestins et utiliser la méthode « Swiss-roll », suivie de techniques d’immunomarquage pour interroger les changements dans le tractus gastro-intestinal.
Abstract
La dysbiose du microbiote intestinal joue un rôle dans la physiopathologie des troubles cardiovasculaires et métaboliques, mais les mécanismes ne sont pas bien compris. La transplantation de microbiote fécal (TMF) est une approche précieuse pour délimiter un rôle direct du microbiote total ou des espèces isolées dans la physiopathologie de la maladie. C’est une option de traitement sûre pour les patients atteints d’une infection récurrente à Clostridium difficile . Des études précliniques démontrent que la manipulation du microbiote intestinal est un outil utile pour étudier le lien mécaniste entre dysbiose et maladie. La transplantation de microbiote fécal peut aider à élucider de nouvelles thérapies ciblant le microbiote intestinal pour la gestion et le traitement des maladies cardiométaboliques. Malgré un taux de réussite élevé chez les rongeurs, il reste des changements translationnels associés à la transplantation. L’objectif ici est de fournir des conseils pour étudier les effets du microbiome intestinal dans les maladies cardiovasculaires expérimentales. Dans cette étude, un protocole détaillé pour la collecte, la manipulation, le traitement et la transplantation du microbiote fécal dans les études sur les murins est décrit. Les étapes de collecte et de traitement sont décrites pour les donneurs humains et les rongeurs. Enfin, nous décrivons l’utilisation d’une combinaison des techniques de roulage suisse et d’immunomarquage pour évaluer la morphologie spécifique de l’intestin et les changements d’intégrité dans les maladies cardiovasculaires et les mécanismes connexes du microbiote intestinal.
Introduction
Les troubles cardiométaboliques, y compris les maladies cardiaques et les accidents vasculaires cérébraux, sont les principales causes mondiales de décès1. L’inactivité physique, une mauvaise alimentation, l’âge avancé et la génétique modulent la physiopathologie de ces troubles. L’accumulation de preuves soutient le concept selon lequel le microbiote intestinal affecte les troubles cardiovasculaires et métaboliques, y comprisle diabète de type 2, l’obésité3 et l’hypertension4, qui pourraient être essentiels au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour ces maladies.
Les mécanismes exacts par lesquels le microbiote cause les maladies sont encore inconnus, et les études actuelles sont très variables, en partie en raison de différences méthodologiques. La transplantation de microbiote fécal (TMF) est une approche précieuse pour délimiter un rôle direct du microbiote total ou des espèces isolées dans la physiopathologie de la maladie. La FMT est largement utilisée dans les études animales pour induire ou supprimer un phénotype. Par exemple, l’apport calorique et le métabolisme du glucose peuvent être modulés en transférant des matières fécales d’un donneur malade à un receveur sain 5,6. Chez l’homme, la FMT s’est avérée être une option de traitement sûre pour les patients atteints d’une infection récurrente à Clostridium difficile 7. Des preuves à l’appui de son utilisation dans la gestion des maladies cardiovasculaires émergent; par exemple, la TMF des patients atteints du syndrome maigre au syndrome métabolique améliore la sensibilité à l’insuline8. La dysbiose intestinale est également associée à l’hypertension artérielle dans les études sur les humains et les rongeurs 9,10,11. La TMF de souris nourries avec un régime riche en sel dans des souris exemptes de germes prédispose les receveurs à l’inflammation et à l’hypertension12.
Malgré le taux élevé de réussite de la FMT chez les rongeurs, des défis de traduction demeurent. Les essais cliniques utilisant la TMF pour traiter l’obésité et le syndrome métabolique indiquent des effets minimes ou nuls sur ces troubles13,14,15. Ainsi, d’autres études sont nécessaires pour identifier des pistes thérapeutiques supplémentaires ciblant le microbiote intestinal pour le traitement des troubles cardiométaboliques. La plupart des preuves disponibles sur le microbiote intestinal et les maladies cardiovasculaires sont associatives. Le protocole décrit explique comment utiliser une combinaison de FMT et de la technique Swiss-rolling pour montrer à la fois une association entre la maladie et le microbiote intestinal et évaluer directement l’intégrité de toutes les parties de l’intestinintestinal 16,17,18.
L’objectif global de cette méthode est de fournir des conseils pour étudier les effets du microbiome intestinal dans les maladies cardiovasculaires expérimentales. Ce protocole fournit plus de détails et de considérations clés dans la conception expérimentale pour promouvoir la traduction physiologique et augmenter la rigueur et la reproductibilité des résultats.
Protocol
Representative Results
Discussion
Une approche utile pour étudier le rôle causal du microbiote intestinal dans les maladies cardiovasculaires et métaboliques consiste à transférer le microbiote total ou certaines espèces d’intérêt chez des souris exemptes de germes. Ici, nous décrivons des protocoles pour collecter des échantillons fécaux chez l’homme et des souris logées de manière conventionnelle dans des souris exemptes de germes afin d’étudier le rôle du microbiote intestinal dans les troubles hypertensifs.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par la subvention UL1TR002243 (à A.K.) du National Center for Advancing Translational Sciences; American Heart Association Grant POST903428 (à J.A.I.); et les subventions K01HL13049, R03HL155041, R01HL144941 du National Heart, Lung, and Blood Institute (à A.K.) et la subvention 1P01HL116263 des NIH (à V.K.). La figure 1 a été créée à l’aide de Biorender.
Materials
| Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoost | ThermoFisher | B40932 | |
| Anaerobic chamber | COY | 7150220 | |
| Apolipoprotein AI | Novus Biologicals | NBP2-52979 | |
| Artery Scissors – Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Bleach solution | Fisher Scientific | 14-412-53 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | B14 | |
| CD3 antibody | ThermoFisher | 14-0032-82 | |
| CD68 monoclonal antibody | ThermoFisher | 14-0681-82 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-221 | |
| CODA high throughput monitor | Kent Scientic Corporation | CODA-HT8 | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
| Disposable graduate transfer pipettes | Fisher Scientific | 137119AM | |
| Disposable syringes | Fisher Scientific | 14-823-2A | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AA33361M1 | |
| Feeding Needle | Fine Science Tools | 18061-38 | |
| Filter (30 µm) | Fisher Scientific | NC0922459 | |
| Filter paper sheet | Fisher Scientific | 09-802 | |
| Formalin (10%) | Fisher Scientific | 23-730-581 | |
| High salt diet | Teklad | TD.03142 | |
| OMNIgene.GUT | DNAgenotek | OM-200+ACP102 | |
| Osmotic mini-pumps | Alzet | MODEL 2002 | |
| PAP Pen | Millipore Sigma | Z377821-1EA | |
| Petri dish | Fisher Scientific | AS4050 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 21-236-18C | |
| Pipettes | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| Serile Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | AAJ61196AP | |
| Smart spatula | Fisher Scientific | NC0133733 | |
| Stool collection device | Fisher Scientific | 50-203-7255 | |
| TBS Buffer | Fisher Scientific | R017R.0000 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | 9036-19-5 |
|
| Varimix platform rocker | Fisher Scientific | 09047113Q | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-41 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 1330-20-7, 100-41-4 |
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