Murine fekal isolasjon og mikrobiotatransplantasjon
Summary
Målet her er å skissere en protokoll for å undersøke mekanismene for dysbiose ved kardiovaskulær sykdom. Denne artikkelen diskuterer hvordan man aseptisk samler og transplanterer murine fekale prøver, isolerer tarmene og bruker “Swiss-roll” -metoden, etterfulgt av immunfargingsteknikker for å forhøre endringer i mage-tarmkanalen.
Abstract
Tarmmikrobiota dysbiose spiller en rolle i patofysiologien av kardiovaskulære og metabolske forstyrrelser, men mekanismene er ikke godt forstått. Fekal mikrobiotatransplantasjon (FMT) er en verdifull tilnærming til å avgrense en direkte rolle for den totale mikrobiota eller isolerte arter i sykdomspatofysiologi. Det er et trygt behandlingsalternativ for pasienter med tilbakevendende Clostridium difficile-infeksjon . Prekliniske studier viser at manipulering av tarmmikrobiota er et nyttig verktøy for å studere den mekanistiske koblingen mellom dysbiose og sykdom. Fekal mikrobiotatransplantasjon kan bidra til å belyse nye tarmmikrobiota-målrettede terapier for behandling og behandling av kardiometabolsk sykdom. Til tross for en høy suksessrate hos gnagere, er det fortsatt translasjonsendringer forbundet med transplantasjonen. Målet her er å gi veiledning i å studere effekten av tarmmikrobiom i eksperimentell kardiovaskulær sykdom. I denne studien er en detaljert protokoll for innsamling, håndtering, behandling og transplantasjon av fekal mikrobiota i murinstudier beskrevet. Innsamlings- og behandlingstrinnene er beskrevet for både menneskelige og gnagerdonorer. Til slutt beskriver vi ved hjelp av en kombinasjon av sveitsiske rullende og immunfargingsteknikker for å vurdere tarmspesifikk morfologi og integritetsendringer i kardiovaskulær sykdom og relaterte tarmmikrobiotamekanismer.
Introduction
Kardiometabolske forstyrrelser, inkludert hjertesykdom og hjerneslag, er de ledende globale dødsårsakene1. Fysisk inaktivitet, dårlig ernæring, fremskreden alder og genetikk modulerer patofysiologien til disse lidelsene. Akkumulerende bevis støtter konseptet om at tarmmikrobiota påvirker kardiovaskulære og metabolske forstyrrelser, inkludert type 2 diabetes2, fedme3 og hypertensjon4, som kan være nøkkelen til utviklingen av nye terapeutiske tilnærminger for disse sykdommene.
De eksakte mekanismene som mikrobiota forårsaker sykdommer er fortsatt ukjente, og nåværende studier er svært variable, delvis på grunn av metodologiske forskjeller. Fekal mikrobiotatransplantasjon (FMT) er en verdifull tilnærming til å avgrense en direkte rolle for den totale mikrobiota eller isolerte arter i sykdomspatofysiologi. FMT er mye brukt i dyreforsøk for å indusere eller undertrykke en fenotype. For eksempel kan kaloriinntak og glukosemetabolisme moduleres ved å overføre avføring fra en syk donor til en frisk mottaker 5,6. Hos mennesker har FMT vist seg å være et trygt behandlingsalternativ for pasienter med tilbakevendende Clostridium difficile-infeksjon 7. Bevis som støtter bruken i kardiovaskulær sykdomsbehandling kommer frem; for eksempel forbedrer FMT fra pasienter med magert til metabolsk syndrom insulinfølsomhet8. Tarmdysbiose er også forbundet med høyt blodtrykk i både humane og gnagerstudier 9,10,11. FMT fra mus matet et høyt salt diett i bakteriefrie mus predisponerer mottakerne for betennelse og hypertensjon12.
Til tross for den høye frekvensen av FMT-suksess hos gnagere, er det fortsatt translasjonsutfordringer. Kliniske studier ved bruk av FMT for å behandle fedme og metabolsk syndrom indikerer minimal eller ingen effekt på disse lidelsene13,14,15. Dermed er det behov for flere studier for å identifisere ytterligere terapeutiske veier rettet mot tarmmikrobiota for behandling av kardiometabolske forstyrrelser. Det meste av tilgjengelig bevis på tarmmikrobiota og kardiovaskulær sykdom er assosiativ. Den beskrevne protokollen diskuterer hvordan man bruker en kombinasjon av FMT og sveitsisk-rullende teknikk for å vise både en sammenheng mellom sykdom og tarmmikrobiota og direkte vurdere integriteten til alle deler av tarmtarmen16,17,18.
Det overordnede målet med denne metoden er å gi veiledning for å studere effekten av tarmmikrobiomet i eksperimentell kardiovaskulær sykdom. Denne protokollen gir flere detaljer og viktige hensyn i eksperimentell design for å fremme fysiologisk oversettelse og øke strengheten og reproduserbarheten av funnene.
Protocol
Representative Results
Discussion
En verdifull tilnærming til å studere den kausale rollen som tarmmikrobiota i kardiovaskulær og metabolsk sykdom er å overføre den totale mikrobiota eller velge arter av interesse til bakteriefrie mus. Her beskriver vi protokoller for å samle fekale prøver fra mennesker og konvensjonelt plassert mus i bakteriefrie mus for å studere rollen som tarmmikrobiota i hypertensive lidelser.
Hos mus bruker vi aseptisk oppsamlet cecalinnhold behandlet i et aerobt kammer, og hos mennesker samler v…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av Vanderbilt Clinical and Translational Science Award Grant UL1TR002243 (til AK) fra National Center for Advancing Translational Sciences; American Heart Association Grant POST903428 (til J.A.I.); og National Heart, Lung, and Blood Institute Grants K01HL13049, R03HL155041, R01HL144941 (til AK), og NIH stipend 1P01HL116263 (til VK). Figur 1 ble laget ved hjelp av Biorender.
Materials
| Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoost | ThermoFisher | B40932 | |
| Anaerobic chamber | COY | 7150220 | |
| Apolipoprotein AI | Novus Biologicals | NBP2-52979 | |
| Artery Scissors – Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Bleach solution | Fisher Scientific | 14-412-53 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | B14 | |
| CD3 antibody | ThermoFisher | 14-0032-82 | |
| CD68 monoclonal antibody | ThermoFisher | 14-0681-82 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-221 | |
| CODA high throughput monitor | Kent Scientic Corporation | CODA-HT8 | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
| Disposable graduate transfer pipettes | Fisher Scientific | 137119AM | |
| Disposable syringes | Fisher Scientific | 14-823-2A | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AA33361M1 | |
| Feeding Needle | Fine Science Tools | 18061-38 | |
| Filter (30 µm) | Fisher Scientific | NC0922459 | |
| Filter paper sheet | Fisher Scientific | 09-802 | |
| Formalin (10%) | Fisher Scientific | 23-730-581 | |
| High salt diet | Teklad | TD.03142 | |
| OMNIgene.GUT | DNAgenotek | OM-200+ACP102 | |
| Osmotic mini-pumps | Alzet | MODEL 2002 | |
| PAP Pen | Millipore Sigma | Z377821-1EA | |
| Petri dish | Fisher Scientific | AS4050 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 21-236-18C | |
| Pipettes | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| Serile Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | AAJ61196AP | |
| Smart spatula | Fisher Scientific | NC0133733 | |
| Stool collection device | Fisher Scientific | 50-203-7255 | |
| TBS Buffer | Fisher Scientific | R017R.0000 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | 9036-19-5 |
|
| Varimix platform rocker | Fisher Scientific | 09047113Q | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-41 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 1330-20-7, 100-41-4 |
Riferimenti
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: a report From the American Heart Association. Circulation. 143 (8), 254 (2021).
- Wu, H., et al. The gut microbiota in prediabetes and diabetes: a population-based cross-sectional study. Cell Metabolism. 32 (3), 379-390 (2020).
- Crovesy, L., Masterson, D., Rosado, E. L. Profile of the gut microbiota of adults with obesity: a systematic review. European Journal of Clinical Nutrition. 74 (9), 1251-1262 (2020).
- Avery, E. G., et al. The gut microbiome in hypertension: recent advances and future perspectives. Circulation Research. 128 (7), 934-950 (2021).
- Perez-Matute, P., Iniguez, M., de Toro, M., Recio-Fernandez, E., Oteo, J. A. Autologous fecal transplantation from a lean state potentiates caloric restriction effects on body weight and adiposity in obese mice. Scientific Reports. 10 (1), 9388 (2020).
- Zoll, J., et al. Fecal microbiota transplantation from high caloric-fed donors alters glucose metabolism in recipient mice, independently of adiposity or exercise status. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 319 (1), 203-216 (2020).
- Hvas, C. L., et al. Fecal microbiota transplantation is superior to fidaxomicin for treatment of recurrent Clostridium difficile infection. Gastroenterology. 156 (5), 1324-1332 (2019).
- Kootte, R. S., et al. Improvement of insulin sensitivity after lean donor feces in metabolic syndrome is driven by baseline intestinal microbiota composition. Cell Metabolism. 26 (4), 611-619 (2017).
- Li, J., et al. Gut microbiota dysbiosis contributes to the development of hypertension. Microbiome. 5 (1), 14 (2017).
- Shi, H., et al. Restructuring the gut microbiota by intermittent fasting lowers blood pressure. Circulation Research. 128 (9), 1240-1254 (2021).
- Zhong, H. J., et al. Washed microbiota transplantation lowers blood pressure in patients with hypertension. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 679624 (2021).
- Ferguson, J. F., et al. High dietary salt-induced dendritic cell activation underlies microbial dysbiosis-associated hypertension. JCI Insight. 5 (13), 126241 (2019).
- Yu, E. W., et al. Fecal microbiota transplantation for the improvement of metabolism in obesity: The FMT-TRIM double-blind placebo-controlled pilot trial. PLoS Medicine. 17 (3), 1003051 (2020).
- Leong, K. S. W., et al. Effects of fecal microbiome transfer in adolescents with obesity: the gut bugs randomized controlled trial. JAMA Network Open. 3 (12), 2030415 (2020).
- Zhang, Z., et al. Impact of fecal microbiota transplantation on obesity and metabolic syndrome-a systematic review. Nutrients. 11 (10), 2291 (2019).
- Laubitz, D., et al. Dynamics of gut microbiota recovery after antibiotic exposure in young and old mice (a pilot study). Microorganisms. 9 (3), 647 (2021).
- Xiao, L., et al. High-fat feeding rather than obesity drives taxonomical and functional changes in the gut microbiota in mice. Microbiome. 5 (1), 43 (2017).
- Brunt, V. E., et al. Suppression of the gut microbiome ameliorates age-related arterial dysfunction and oxidative stress in mice. The Journal of Physiology. 597 (9), 2361-2378 (2019).
- Choo, J. M., Rogers, G. B. Gut microbiota transplantation for colonization of germ-free mice. STAR Protocols. 2 (3), 100610 (2021).
- Kim, T. T., et al. Fecal transplant from resveratrol-fed donors improves glycaemia and cardiovascular features of the metabolic syndrome in mice. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 315 (4), 511-519 (2018).
- Lu, H., et al. Subcutaneous angiotensin II infusion using osmotic pumps induces aortic aneurysms in mice. Journal of Visualized Experiments. (103), e53191 (2015).
- Wang, Y., Thatcher, S. E., Cassis, L. A. Measuring blood pressure using a noninvasive tail cuff method in mice. Methods in Molecular Biology. 1614, 69-73 (2017).
- Ishimwe, J. A., et al. The gut microbiota and short-chain fatty acids profile in postural orthostatic tachycardia syndrome. Frontiers in Physiology. 13, 879012 (2022).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
- Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Laboratory Animals. 15 (1), 57-59 (1981).
- Ishimwe, J. A., Garrett, M. R., Sasser, J. M. 1,3-Butanediol attenuates hypertension and suppresses kidney injury in female rats. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 319 (1), 106-114 (2020).
- Bokoliya, S. C., Dorsett, Y., Panier, H., Zhou, Y. Procedures for fecal microbiota transplantation in murine microbiome studies. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711055 (2021).
- Van Beusecum, J. P., Xiao, L., Barbaro, N. R., Patrick, D. M., Kirabo, A. Isolation and adoptive transfer of high salt treated antigen-presenting dendritic cells. Journal of Visualized Experiments. (145), e59124 (2019).
- Harrison, D. G., Marvar, P. J., Titze, J. M. Vascular inflammatory cells in hypertension. Frontiers in Physiology. 3, 128 (2012).
- Sylvester, M. A., et al. Splenocyte transfer from hypertensive donors eliminates premenopausal female protection from ANG II-induced hypertension. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 322 (3), 245-257 (2022).
- Reikvam, D. H., et al. Depletion of murine intestinal microbiota: effects on gut mucosa and epithelial gene expression. PLoS One. 6 (3), 17996 (2011).
- Le Roy, T., et al. Comparative evaluation of microbiota engraftment following fecal microbiota transfer in mice models: age, kinetic and microbial status matter. Frontiers in Microbiology. 9, 3289 (2019).
- Sun, J., et al. Fecal microbiota transplantation alleviated Alzheimer’s disease-like pathogenesis in APP/PS1 transgenic mice. Translation Psychiatry. 9 (1), 189 (2019).
- Kim, M., et al. Critical role for the microbiota in CX(3)CR1(+) intestinal mononuclear phagocyte regulation of intestinal T cell responses. Immunity. 49 (3), 151-163 (2018).
- Hintze, K. J., et al. Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer. Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).
- Wilde, E., et al. Tail-cuff technique and its influence on central blood pressure in the mouse. Journal of the American Heart Association. 6 (6), 005204 (2017).
- Liu, X., et al. High-fiber diet mitigates maternal obesity-induced cognitive and social dysfunction in the offspring via gut-brain axis. Cell Metabolism. 33 (5), 923-938 (2021).
