Aislamiento fecal murino y trasplante de microbiota
Summary
El objetivo aquí es delinear un protocolo para investigar los mecanismos de la disbiosis en la enfermedad cardiovascular. Este documento discute cómo recolectar y trasplantar asépticamente muestras fecales murinas, aislar intestinos y usar el método “Swiss-roll”, seguido de técnicas de inmunotinción para interrogar los cambios en el tracto gastrointestinal.
Abstract
La disbiosis de la microbiota intestinal desempeña un papel en la fisiopatología de los trastornos cardiovasculares y metabólicos, pero los mecanismos no se comprenden bien. El trasplante de microbiota fecal (TMF) es un enfoque valioso para delinear un papel directo de la microbiota total o de las especies aisladas en la fisiopatología de la enfermedad. Es una opción de tratamiento segura para pacientes con infección recurrente por Clostridium difficile . Los estudios preclínicos demuestran que la manipulación de la microbiota intestinal es una herramienta útil para estudiar el vínculo mecanicista entre la disbiosis y la enfermedad. El trasplante de microbiota fecal puede ayudar a dilucidar nuevas terapias dirigidas a la microbiota intestinal para el tratamiento y la enfermedad cardiometabólica. A pesar de una alta tasa de éxito en roedores, sigue habiendo cambios de traslación asociados con el trasplante. El objetivo aquí es proporcionar orientación en el estudio de los efectos del microbioma intestinal en la enfermedad cardiovascular experimental. En este estudio, se describe un protocolo detallado para la recolección, manipulación, procesamiento y trasplante de microbiota fecal en estudios murinos. Los pasos de recolección y procesamiento se describen tanto para donantes humanos como para roedores. Por último, describimos el uso de una combinación de las técnicas suizas de laminación e inmunotinción para evaluar la morfología específica del intestino y los cambios en la integridad de las enfermedades cardiovasculares y los mecanismos relacionados con la microbiota intestinal.
Introduction
Los trastornos cardiometabólicos, incluidas las cardiopatías y los accidentes cerebrovasculares, son las principales causas mundiales de muerte1. La inactividad física, la mala nutrición, la edad avanzada y la genética modulan la fisiopatología de estos trastornos. La evidencia acumulada respalda el concepto de que la microbiota intestinal afecta a los trastornos cardiovasculares y metabólicos, incluidala diabetes tipo 2, la obesidad3 y la hipertensión4, que pueden ser clave para el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos para estas enfermedades.
Los mecanismos exactos por los cuales la microbiota causa enfermedades aún se desconocen, y los estudios actuales son muy variables, en parte debido a diferencias metodológicas. El trasplante de microbiota fecal (TMF) es un enfoque valioso para delinear un papel directo de la microbiota total o de las especies aisladas en la fisiopatología de la enfermedad. El TMF es ampliamente utilizado en estudios con animales para inducir o suprimir un fenotipo. Por ejemplo, la ingesta calórica y el metabolismo de la glucosa pueden ser modulados mediante la transferencia de materia fecal de un donante enfermo a un receptor sano 5,6. En humanos, el TMF ha demostrado ser una opción de tratamiento segura para pacientes con infección recurrente por Clostridium difficile 7. Está surgiendo evidencia que apoya su uso en el tratamiento de las enfermedades cardiovasculares; por ejemplo, el TMF de pacientes con síndrome metabólico a delgado mejora la sensibilidad a la insulina8. La disbiosis intestinal también se asocia con presión arterial alta en estudios en humanos y roedores 9,10,11. El TMF de ratones alimentados con una dieta alta en sal en ratones libres de gérmenes predispone a los receptores a la inflamación y la hipertensión12.
A pesar de la alta tasa de éxito del FMT en roedores, persisten los desafíos traslacionales. Los ensayos clínicos que utilizan FMT para tratar la obesidad y el síndrome metabólico indican efectos mínimos o nulos sobre estos trastornos13,14,15. Por lo tanto, se necesitan más estudios para identificar vías terapéuticas adicionales dirigidas a la microbiota intestinal para el tratamiento de trastornos cardiometabólicos. La mayor parte de la evidencia disponible sobre la microbiota intestinal y las enfermedades cardiovasculares es asociativa. El protocolo descrito discute cómo utilizar una combinación de FMT y la técnica de laminación suiza para mostrar una asociación entre la enfermedad y la microbiota intestinal y evaluar directamente la integridad de todas las partes del intestinointestinal 16,17,18.
El objetivo general de este método es proporcionar orientación para estudiar los efectos del microbioma intestinal en la enfermedad cardiovascular experimental. Este protocolo proporciona más detalles y consideraciones clave en el diseño experimental para promover la traducción fisiológica y aumentar el rigor y la reproducibilidad de los hallazgos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un enfoque valioso para estudiar el papel causal de la microbiota intestinal en las enfermedades cardiovasculares y metabólicas es transferir la microbiota total o seleccionar especies de interés en ratones libres de gérmenes. Aquí, describimos protocolos para recolectar muestras fecales de humanos y ratones alojados convencionalmente en ratones libres de gérmenes para estudiar el papel de la microbiota intestinal en los trastornos hipertensivos.
En ratones, utilizamos contenidos cecales …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por Vanderbilt Clinical and Translational Science Award Grant UL1TR002243 (a A.K.) del Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales; Subvención POST903428 de la American Heart Association (a J.A.I.); y las subvenciones K01HL13049, R03HL155041, R01449 del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre (a A.K.) y la subvención de los NIH 1P01HL116263 (a V.K.). La Figura 1 fue creada usando Biorender.
Materials
| Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoost | ThermoFisher | B40932 | |
| Anaerobic chamber | COY | 7150220 | |
| Apolipoprotein AI | Novus Biologicals | NBP2-52979 | |
| Artery Scissors – Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Bleach solution | Fisher Scientific | 14-412-53 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | B14 | |
| CD3 antibody | ThermoFisher | 14-0032-82 | |
| CD68 monoclonal antibody | ThermoFisher | 14-0681-82 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-221 | |
| CODA high throughput monitor | Kent Scientic Corporation | CODA-HT8 | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
| Disposable graduate transfer pipettes | Fisher Scientific | 137119AM | |
| Disposable syringes | Fisher Scientific | 14-823-2A | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AA33361M1 | |
| Feeding Needle | Fine Science Tools | 18061-38 | |
| Filter (30 µm) | Fisher Scientific | NC0922459 | |
| Filter paper sheet | Fisher Scientific | 09-802 | |
| Formalin (10%) | Fisher Scientific | 23-730-581 | |
| High salt diet | Teklad | TD.03142 | |
| OMNIgene.GUT | DNAgenotek | OM-200+ACP102 | |
| Osmotic mini-pumps | Alzet | MODEL 2002 | |
| PAP Pen | Millipore Sigma | Z377821-1EA | |
| Petri dish | Fisher Scientific | AS4050 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 21-236-18C | |
| Pipettes | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| Serile Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | AAJ61196AP | |
| Smart spatula | Fisher Scientific | NC0133733 | |
| Stool collection device | Fisher Scientific | 50-203-7255 | |
| TBS Buffer | Fisher Scientific | R017R.0000 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | 9036-19-5 |
|
| Varimix platform rocker | Fisher Scientific | 09047113Q | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-41 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 1330-20-7, 100-41-4 |
Riferimenti
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