Murin fekal isolering och mikrobiotatransplantation
Summary
Målet här är att skissera ett protokoll för att undersöka mekanismerna för dysbios vid hjärt-kärlsjukdom. Denna uppsats diskuterar hur man aseptiskt samlar in och transplanterar murina fekalprover, isolerar tarmar och använder “Swiss-roll” -metoden, följt av immunfärgningstekniker för att förhöra förändringar i mag-tarmkanalen.
Abstract
Tarmmikrobiota dysbios spelar en roll i patofysiologin för kardiovaskulära och metaboliska störningar, men mekanismerna är inte väl förstådda. Fekal mikrobiotatransplantation (FMT) är ett värdefullt tillvägagångssätt för att avgränsa en direkt roll för den totala mikrobioten eller isolerade arter i sjukdomspatofysiologi. Det är ett säkert behandlingsalternativ för patienter med återkommande Clostridium difficile-infektion . Prekliniska studier visar att manipulering av tarmmikrobioten är ett användbart verktyg för att studera den mekanistiska kopplingen mellan dysbios och sjukdom. Fekal mikrobiotatransplantation kan hjälpa till att belysa nya tarmmikrobiota-riktade terapier för hantering och behandling av kardiometabola sjukdomar. Trots en hög framgångsgrad hos gnagare kvarstår translationella förändringar i samband med transplantationen. Målet här är att ge vägledning för att studera effekterna av tarmmikrobiom vid experimentell hjärt-kärlsjukdom. I denna studie beskrivs ett detaljerat protokoll för insamling, hantering, bearbetning och transplantation av fekal mikrobiota i murina studier. Insamlings- och bearbetningsstegen beskrivs för donatorer från både människor och gnagare. Slutligen beskriver vi hur man använder en kombination av schweiziska rullnings- och immunfärgningstekniker för att bedöma tarmspecifik morfologi och integritetsförändringar i hjärt-kärlsjukdom och relaterade tarmmikrobiotamekanismer.
Introduction
Kardiometaboliska störningar, inklusive hjärtsjukdomar och stroke, är de ledande globala dödsorsakerna1. Fysisk inaktivitet, dålig näring, stigande ålder och genetik modulerar patofysiologin för dessa störningar. Ackumulerande bevis stöder konceptet att tarmmikrobiota påverkar kardiovaskulära och metaboliska störningar, inklusive typ 2-diabetes2, fetma3 och högt blodtryck4, vilket kan vara nyckeln till utvecklingen av nya terapeutiska metoder för dessa sjukdomar.
De exakta mekanismerna genom vilka mikrobiotan orsakar sjukdomar är fortfarande okända, och aktuella studier är mycket varierande, delvis på grund av metodologiska skillnader. Fekal mikrobiotatransplantation (FMT) är ett värdefullt tillvägagångssätt för att avgränsa en direkt roll för den totala mikrobioten eller isolerade arter i sjukdomspatofysiologi. FMT används ofta i djurstudier för att inducera eller undertrycka en fenotyp. Till exempel kan kaloriintag och glukosmetabolism moduleras genom att överföra fekal materia från en sjuk givare till en frisk mottagare 5,6. Hos människa har FMT visat sig vara ett säkert behandlingsalternativ för patienter med återkommande Clostridium difficile-infektion 7. Bevis som stöder dess användning vid hantering av hjärt-kärlsjukdomar växer fram; till exempel förbättrar FMT från mager till metabola patienter insulinkänsligheten8. Tarmdysbios är också associerad med högt blodtryck i både human- och gnagarestudier 9,10,11. FMT från möss som matas med en hög saltdiet i bakteriefria möss predisponerar mottagarna för inflammation och högt blodtryck12.
Trots den höga graden av FMT-framgång hos gnagare kvarstår translationella utmaningar. Kliniska prövningar med FMT för att behandla fetma och metaboliskt syndrom indikerar minimala eller inga effekter på dessa störningar13,14,15. Således behövs fler studier för att identifiera ytterligare terapeutiska vägar som riktar sig mot tarmmikrobioten för behandling av kardiometaboliska störningar. De flesta av de tillgängliga bevisen på tarmmikrobioten och hjärt-kärlsjukdom är associativa. Det beskrivna protokollet diskuterar hur man använder en kombination av FMT och den schweiziska rullningstekniken för att visa både ett samband mellan sjukdom och tarmmikrobiota och direkt bedöma integriteten hos alla delar av tarmen16,17,18.
Det övergripande målet med denna metod är att ge vägledning för att studera effekterna av tarmmikrobiomet vid experimentell hjärt-kärlsjukdom. Detta protokoll ger mer detaljer och viktiga överväganden i den experimentella designen för att främja fysiologisk översättning och öka noggrannheten och reproducerbarheten av resultaten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ett värdefullt tillvägagångssätt för att studera tarmmikrobiotans kausala roll i kardiovaskulär och metabolisk sjukdom är att överföra den totala mikrobioten eller välja arter av intresse till bakteriefria möss. Här beskriver vi protokoll för att samla fekala prover från människor och konventionellt inrymda möss i bakteriefria möss för att studera tarmmikrobiotans roll vid hypertensiva störningar.
Hos möss använder vi aseptiskt uppsamlat cecalinnehåll som bearbetas i en a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av Vanderbilt Clinical and Translational Science Award Grant UL1TR002243 (till A.K.) från National Center for Advancing Translational Sciences; American Heart Association Grant POST903428 (till J.A.I.); och National Heart, Lung and Blood Institute Grants K01HL13049, R03HL155041, R01HL144941 (till A.K.) och NIH-bidrag 1P01HL116263 (till V.K.). Figur 1 skapades med Biorender.
Materials
| Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoost | ThermoFisher | B40932 | |
| Anaerobic chamber | COY | 7150220 | |
| Apolipoprotein AI | Novus Biologicals | NBP2-52979 | |
| Artery Scissors – Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Bleach solution | Fisher Scientific | 14-412-53 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | B14 | |
| CD3 antibody | ThermoFisher | 14-0032-82 | |
| CD68 monoclonal antibody | ThermoFisher | 14-0681-82 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-221 | |
| CODA high throughput monitor | Kent Scientic Corporation | CODA-HT8 | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
| Disposable graduate transfer pipettes | Fisher Scientific | 137119AM | |
| Disposable syringes | Fisher Scientific | 14-823-2A | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AA33361M1 | |
| Feeding Needle | Fine Science Tools | 18061-38 | |
| Filter (30 µm) | Fisher Scientific | NC0922459 | |
| Filter paper sheet | Fisher Scientific | 09-802 | |
| Formalin (10%) | Fisher Scientific | 23-730-581 | |
| High salt diet | Teklad | TD.03142 | |
| OMNIgene.GUT | DNAgenotek | OM-200+ACP102 | |
| Osmotic mini-pumps | Alzet | MODEL 2002 | |
| PAP Pen | Millipore Sigma | Z377821-1EA | |
| Petri dish | Fisher Scientific | AS4050 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 21-236-18C | |
| Pipettes | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| Serile Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | AAJ61196AP | |
| Smart spatula | Fisher Scientific | NC0133733 | |
| Stool collection device | Fisher Scientific | 50-203-7255 | |
| TBS Buffer | Fisher Scientific | R017R.0000 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | 9036-19-5 |
|
| Varimix platform rocker | Fisher Scientific | 09047113Q | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-41 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 1330-20-7, 100-41-4 |
Riferimenti
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: a report From the American Heart Association. Circulation. 143 (8), 254 (2021).
- Wu, H., et al. The gut microbiota in prediabetes and diabetes: a population-based cross-sectional study. Cell Metabolism. 32 (3), 379-390 (2020).
- Crovesy, L., Masterson, D., Rosado, E. L. Profile of the gut microbiota of adults with obesity: a systematic review. European Journal of Clinical Nutrition. 74 (9), 1251-1262 (2020).
- Avery, E. G., et al. The gut microbiome in hypertension: recent advances and future perspectives. Circulation Research. 128 (7), 934-950 (2021).
- Perez-Matute, P., Iniguez, M., de Toro, M., Recio-Fernandez, E., Oteo, J. A. Autologous fecal transplantation from a lean state potentiates caloric restriction effects on body weight and adiposity in obese mice. Scientific Reports. 10 (1), 9388 (2020).
- Zoll, J., et al. Fecal microbiota transplantation from high caloric-fed donors alters glucose metabolism in recipient mice, independently of adiposity or exercise status. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 319 (1), 203-216 (2020).
- Hvas, C. L., et al. Fecal microbiota transplantation is superior to fidaxomicin for treatment of recurrent Clostridium difficile infection. Gastroenterology. 156 (5), 1324-1332 (2019).
- Kootte, R. S., et al. Improvement of insulin sensitivity after lean donor feces in metabolic syndrome is driven by baseline intestinal microbiota composition. Cell Metabolism. 26 (4), 611-619 (2017).
- Li, J., et al. Gut microbiota dysbiosis contributes to the development of hypertension. Microbiome. 5 (1), 14 (2017).
- Shi, H., et al. Restructuring the gut microbiota by intermittent fasting lowers blood pressure. Circulation Research. 128 (9), 1240-1254 (2021).
- Zhong, H. J., et al. Washed microbiota transplantation lowers blood pressure in patients with hypertension. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 679624 (2021).
- Ferguson, J. F., et al. High dietary salt-induced dendritic cell activation underlies microbial dysbiosis-associated hypertension. JCI Insight. 5 (13), 126241 (2019).
- Yu, E. W., et al. Fecal microbiota transplantation for the improvement of metabolism in obesity: The FMT-TRIM double-blind placebo-controlled pilot trial. PLoS Medicine. 17 (3), 1003051 (2020).
- Leong, K. S. W., et al. Effects of fecal microbiome transfer in adolescents with obesity: the gut bugs randomized controlled trial. JAMA Network Open. 3 (12), 2030415 (2020).
- Zhang, Z., et al. Impact of fecal microbiota transplantation on obesity and metabolic syndrome-a systematic review. Nutrients. 11 (10), 2291 (2019).
- Laubitz, D., et al. Dynamics of gut microbiota recovery after antibiotic exposure in young and old mice (a pilot study). Microorganisms. 9 (3), 647 (2021).
- Xiao, L., et al. High-fat feeding rather than obesity drives taxonomical and functional changes in the gut microbiota in mice. Microbiome. 5 (1), 43 (2017).
- Brunt, V. E., et al. Suppression of the gut microbiome ameliorates age-related arterial dysfunction and oxidative stress in mice. The Journal of Physiology. 597 (9), 2361-2378 (2019).
- Choo, J. M., Rogers, G. B. Gut microbiota transplantation for colonization of germ-free mice. STAR Protocols. 2 (3), 100610 (2021).
- Kim, T. T., et al. Fecal transplant from resveratrol-fed donors improves glycaemia and cardiovascular features of the metabolic syndrome in mice. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 315 (4), 511-519 (2018).
- Lu, H., et al. Subcutaneous angiotensin II infusion using osmotic pumps induces aortic aneurysms in mice. Journal of Visualized Experiments. (103), e53191 (2015).
- Wang, Y., Thatcher, S. E., Cassis, L. A. Measuring blood pressure using a noninvasive tail cuff method in mice. Methods in Molecular Biology. 1614, 69-73 (2017).
- Ishimwe, J. A., et al. The gut microbiota and short-chain fatty acids profile in postural orthostatic tachycardia syndrome. Frontiers in Physiology. 13, 879012 (2022).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
- Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Laboratory Animals. 15 (1), 57-59 (1981).
- Ishimwe, J. A., Garrett, M. R., Sasser, J. M. 1,3-Butanediol attenuates hypertension and suppresses kidney injury in female rats. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 319 (1), 106-114 (2020).
- Bokoliya, S. C., Dorsett, Y., Panier, H., Zhou, Y. Procedures for fecal microbiota transplantation in murine microbiome studies. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711055 (2021).
- Van Beusecum, J. P., Xiao, L., Barbaro, N. R., Patrick, D. M., Kirabo, A. Isolation and adoptive transfer of high salt treated antigen-presenting dendritic cells. Journal of Visualized Experiments. (145), e59124 (2019).
- Harrison, D. G., Marvar, P. J., Titze, J. M. Vascular inflammatory cells in hypertension. Frontiers in Physiology. 3, 128 (2012).
- Sylvester, M. A., et al. Splenocyte transfer from hypertensive donors eliminates premenopausal female protection from ANG II-induced hypertension. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 322 (3), 245-257 (2022).
- Reikvam, D. H., et al. Depletion of murine intestinal microbiota: effects on gut mucosa and epithelial gene expression. PLoS One. 6 (3), 17996 (2011).
- Le Roy, T., et al. Comparative evaluation of microbiota engraftment following fecal microbiota transfer in mice models: age, kinetic and microbial status matter. Frontiers in Microbiology. 9, 3289 (2019).
- Sun, J., et al. Fecal microbiota transplantation alleviated Alzheimer’s disease-like pathogenesis in APP/PS1 transgenic mice. Translation Psychiatry. 9 (1), 189 (2019).
- Kim, M., et al. Critical role for the microbiota in CX(3)CR1(+) intestinal mononuclear phagocyte regulation of intestinal T cell responses. Immunity. 49 (3), 151-163 (2018).
- Hintze, K. J., et al. Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer. Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).
- Wilde, E., et al. Tail-cuff technique and its influence on central blood pressure in the mouse. Journal of the American Heart Association. 6 (6), 005204 (2017).
- Liu, X., et al. High-fiber diet mitigates maternal obesity-induced cognitive and social dysfunction in the offspring via gut-brain axis. Cell Metabolism. 33 (5), 923-938 (2021).
