Buradaki amaç, kardiyovasküler hastalıklarda dysbiosis mekanizmalarını araştırmak için bir protokolün ana hatlarını çizmektir. Bu yazıda, murin dışkı örneklerinin aseptik olarak nasıl toplanacağı ve nakledileceği, bağırsakların nasıl izole edileceği ve “Swiss-roll” yönteminin nasıl kullanılacağı, ardından gastrointestinal sistemdeki değişiklikleri sorgulamak için immün boyama teknikleri tartışılmaktadır.
Bağırsak mikrobiyota dysbiosis, kardiyovasküler ve metabolik bozuklukların patofizyolojisinde rol oynar, ancak mekanizmaları iyi anlaşılmamıştır. Fekal mikrobiyota transplantasyonu (FMT), hastalık patofizyolojisinde total mikrobiyota veya izole türlerin doğrudan rolünü tanımlamak için değerli bir yaklaşımdır. Tekrarlayan Clostridium difficile enfeksiyonu olan hastalar için güvenli bir tedavi seçeneğidir. Preklinik çalışmalar, bağırsak mikrobiyotasını manipüle etmenin, dysbiosis ve hastalık arasındaki mekanik bağlantıyı incelemek için yararlı bir araç olduğunu göstermektedir. Fekal mikrobiyota transplantasyonu, kardiyometabolik hastalıkların yönetimi ve tedavisi için yeni bağırsak mikrobiyota hedefli terapötiklerin aydınlatılmasına yardımcı olabilir. Kemirgenlerde yüksek başarı oranına rağmen, transplantasyonla ilişkili translasyonel değişiklikler devam etmektedir. Buradaki amaç, bağırsak mikrobiyomunun deneysel kardiyovasküler hastalıklardaki etkilerini incelemede rehberlik etmektir. Bu çalışmada, murin çalışmalarında fekal mikrobiyotanın toplanması, işlenmesi, işlenmesi ve transplantasyonu için ayrıntılı bir protokol tanımlanmıştır. Toplama ve işleme adımları hem insan hem de kemirgen donörleri için açıklanmıştır. Son olarak, kardiyovasküler hastalıklarda ve ilgili bağırsak mikrobiyota mekanizmalarında bağırsaklara özgü morfoloji ve bütünlük değişikliklerini değerlendirmek için İsviçre yuvarlanma ve immün boyama tekniklerinin bir kombinasyonunu kullanmayı tanımladık.
Kalp hastalığı ve inme de dahil olmak üzere kardiyometabolik bozukluklar, önde gelen küresel ölüm nedenleridir1. Fiziksel hareketsizlik, yetersiz beslenme, ilerleyen yaş ve genetik bu hastalıkların patofizyolojisini modüle etmektedir. Biriken kanıtlar, bağırsak mikrobiyotasının tip 2 diyabet2, obezite3 ve hipertansiyon4 dahil olmak üzere kardiyovasküler ve metabolik bozuklukları etkilediği kavramını desteklemektedir ve bu da bu hastalıklar için yeni terapötik yaklaşımların geliştirilmesinde bir anahtar tutabilir.
Mikrobiyotanın hastalıklara neden olduğu kesin mekanizmalar hala bilinmemektedir ve mevcut çalışmalar kısmen metodolojik farklılıklar nedeniyle oldukça değişkendir. Fekal mikrobiyota transplantasyonu (FMT), hastalık patofizyolojisinde total mikrobiyota veya izole türlerin doğrudan rolünü tanımlamak için değerli bir yaklaşımdır. FMT, hayvan çalışmalarında bir fenotipi indüklemek veya bastırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Örneğin, kalori alımı ve glikoz metabolizması, dışkı maddesinin hasta bir donörden sağlıklı bir alıcıya aktarılmasıyla modüle edilebilir 5,6. İnsanlarda, FMT’nin tekrarlayan Clostridium difficile enfeksiyonu olan hastalar için güvenli bir tedavi seçeneği olduğu gösterilmiştir7. Kardiyovasküler hastalık yönetiminde kullanımını destekleyen kanıtlar ortaya çıkmaktadır; Örneğin, yağsız ve metabolik sendromlu hastalardan FMT, insülin duyarlılığını artırır8. Bağırsak dysbiosis ayrıca hem insan hem de kemirgen çalışmalarında yüksek tansiyon ile ilişkilidir 9,10,11. Mikropsuz farelere yüksek tuzlu bir diyetle beslenen farelerden elde edilen FMT, alıcıları inflamasyona ve hipertansiyona yatkınlaştırır12.
Kemirgenlerde FMT başarısının yüksek oranına rağmen, translasyonel zorluklar devam etmektedir. Obezite ve metabolik sendromu tedavi etmek için FMT kullanan klinik çalışmalar, bu bozukluklar üzerinde minimal veya hiç etki göstermemektedir13,14,15. Bu nedenle, kardiyometabolik bozuklukların tedavisi için bağırsak mikrobiyotasını hedef alan ek terapötik yolları tanımlamak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır. Bağırsak mikrobiyotası ve kardiyovasküler hastalık ile ilgili mevcut kanıtların çoğu ilişkiseldir. Açıklanan protokol, hem hastalık hem de bağırsak mikrobiyotası arasındaki ilişkiyi göstermek ve bağırsak bağırsağının tüm bölümlerinin bütünlüğünü doğrudan değerlendirmek için FMT ve İsviçre yuvarlanma tekniğinin bir kombinasyonunun nasıl kullanılacağını tartışmaktadır16,17,18.
Bu yöntemin genel amacı, bağırsak mikrobiyomunun deneysel kardiyovasküler hastalıklardaki etkilerini incelemek için rehberlik sağlamaktır. Bu protokol, fizyolojik çeviriyi teşvik etmek ve bulguların titizliğini ve tekrarlanabilirliğini artırmak için deneysel tasarımda daha fazla ayrıntı ve önemli hususlar sağlar.
Bağırsak mikrobiyotasının kardiyovasküler ve metabolik hastalıklardaki nedensel rolünü incelemek için değerli bir yaklaşım, toplam mikrobiyotayı veya ilgilenilen türleri mikropsuz farelere aktarmaktır. Burada, hipertansif bozukluklarda bağırsak mikrobiyotasının rolünü incelemek için insanlardan dışkı örnekleri toplamak için protokolleri ve geleneksel olarak barındırılan fareleri mikropsuz farelere dönüştürüyoruz.
Farelerde, aerobik bir odada işlenmiş asepti…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Ulusal Translasyonel Bilimleri Geliştirme Merkezi’nden Vanderbilt Klinik ve Translasyonel Bilim Ödülü Hibesi UL1TR002243 (AK’ye) tarafından desteklenmiştir; Amerikan Kalp Derneği Hibe POST903428 (J.A.I.’ye); ve Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü Hibeleri K01HL13049, R03HL155041, R01HL144941 (AK’ye) ve NIH hibe 1P01HL116263 (V.K.’ye). Şekil 1 , Biorender kullanılarak oluşturulmuştur.
Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoost | ThermoFisher | B40932 | |
Anaerobic chamber | COY | 7150220 | |
Apolipoprotein AI | Novus Biologicals | NBP2-52979 | |
Artery Scissors – Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
Bleach solution | Fisher Scientific | 14-412-53 | |
Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | B14 | |
CD3 antibody | ThermoFisher | 14-0032-82 | |
CD68 monoclonal antibody | ThermoFisher | 14-0681-82 | |
Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-221 | |
CODA high throughput monitor | Kent Scientic Corporation | CODA-HT8 | |
Cryogenic vials | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
Disposable graduate transfer pipettes | Fisher Scientific | 137119AM | |
Disposable syringes | Fisher Scientific | 14-823-2A | |
Ethanol | Fisher Scientific | AA33361M1 | |
Feeding Needle | Fine Science Tools | 18061-38 | |
Filter (30 µm) | Fisher Scientific | NC0922459 | |
Filter paper sheet | Fisher Scientific | 09-802 | |
Formalin (10%) | Fisher Scientific | 23-730-581 | |
High salt diet | Teklad | TD.03142 | |
OMNIgene.GUT | DNAgenotek | OM-200+ACP102 | |
Osmotic mini-pumps | Alzet | MODEL 2002 | |
PAP Pen | Millipore Sigma | Z377821-1EA | |
Petri dish | Fisher Scientific | AS4050 | |
Pipette tips | Fisher Scientific | 21-236-18C | |
Pipettes | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
Serile Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | AAJ61196AP | |
Smart spatula | Fisher Scientific | NC0133733 | |
Stool collection device | Fisher Scientific | 50-203-7255 | |
TBS Buffer | Fisher Scientific | R017R.0000 | |
Triton X-100 | Millipore Sigma | 9036-19-5 |
|
Varimix platform rocker | Fisher Scientific | 09047113Q | |
Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-41 | |
Xylene | Fisher Scientific | 1330-20-7, 100-41-4 |