Microiniezioni ventricolari cerebrali di lipopolisaccaride in larve di zebrafish per valutare la neuroinfiammazione e la neurotossicità

Summary

Questo protocollo dimostra la microiniezione di lipopolisaccaride nella regione ventricolare del cervello in un modello larvale di zebrafish per studiare la risposta neuroinfiammatoria risultante e la neurotossicità.

Abstract

La neuroinfiammazione è un attore chiave in vari disturbi neurologici, comprese le malattie neurodegenerative. Pertanto, è di grande interesse ricercare e sviluppare modelli alternativi di neuroinfiammazione in vivo per comprendere il ruolo della neuroinfiammazione nella neurodegenerazione. In questo studio, è stato sviluppato e convalidato un modello larvale di zebrafish di neuroinfiammazione mediata da microiniezione ventricolare di lipopolisaccaride (LPS) per indurre una risposta immunitaria e neurotossicità. Le linee transgeniche di zebrafish elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP e mpo:EGFP sono state utilizzate per la quantificazione in tempo reale della vitalità dei neuroni cerebrali mediante imaging live a fluorescenza integrato con l'analisi dell'intensità di fluorescenza. Il comportamento locomotore delle larve di zebrafish è stato registrato automaticamente utilizzando un registratore di tracciamento video. Il contenuto di ossido nitrico (NO) e i livelli di espressione dell'mRNA delle citochine infiammatorie tra cui l'interleuchina-6 (IL-6), l'interleuchina-1β (IL-1β) e il fattore di necrosi tumorale umano α (TNF-α) sono stati studiati per valutare la risposta immunitaria indotta da LPS nella testa larvale del pesce zebra. A 24 ore dopo l'iniezione ventricolare cerebrale di LPS, sono stati osservati perdita di neuroni e deficit di locomozione nelle larve di zebrafish. Inoltre, la neuroinfiammazione indotta da LPS ha aumentato il rilascio di NO e l'espressione di mRNA di IL-6, IL-1β e TNF-α nella testa delle larve di zebrafish 6 giorni dopo la fecondazione (DPF) e ha portato al reclutamento di neutrofili nel cervello del pesce zebra. In questo studio, l'iniezione di zebrafish con LPS ad una concentrazione di 2,5-5 mg/ml a 5 dpf è stata determinata come condizione ottimale per questo test farmacologico di neuroinfiammazione. Questo protocollo presenta una metodologia nuova, rapida ed efficiente per la microiniezione di LPS nel ventricolo cerebrale per indurre neuroinfiammazione e neurotossicità mediate da LPS in una larva di zebrafish, che è utile per studiare la neuroinfiammazione e potrebbe anche essere utilizzata come test di screening farmacologico in vivo ad alto rendimento.

Introduction

La neuroinfiammazione è stata descritta come un fattore antineurogeno cruciale coinvolto nella patogenesi di diverse malattie neurodegenerative del sistema nervoso centrale (SNC)¹. A seguito di insulti patologici, la neuroinfiammazione può provocare varie conseguenze avverse, tra cui l'inibizione della neurogenesi e l'induzione della morte delle cellule neuronali ^2,3. Nel processo alla base della risposta all'induzione dell'infiammazione, citochine infiammatorie multiple (come TNF-α, IL-1β e IL-6) sono secrete nello spazio extracellulare e agiscono come componenti cruciali nella morte n....

Protocol

Le linee di zebrafish selvatico AB e zebrafish transgenico elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP e mpo:EGFP sono state ottenute dall'Istituto di scienze mediche cinesi (ICMS). L'approvazione etica (UMARE-030-2017) per gli esperimenti sugli animali è stata concessa dal Comitato etico per la ricerca sugli animali, Università di Macao, e il protocollo segue le linee guida istituzionali per la cura degli animali.

1. Embrioni di zebrafish e allevamento larvale

1. Generare embrioni di zebrafish (200-300 embrioni per accoppiamento) mediante accoppiamento naturale a coppie come precedentemente riportato²⁸.
....

Results

Il flusso di lavoro qui descritto presenta una metodologia nuova, rapida ed efficiente per indurre neuroinfiammazione e neurotossicità mediate da LPS nelle larve di zebrafish. In questo protocollo descritto, 5 dpf zebrafish sono stati iniettati con LPS (Figura 1) nei ventricoli cerebrali utilizzando un microiniettore (Figura 2A-C). L'iniezione riuscita nel sito del ventricolo cerebrale è stata verificata utilizzando la colorazio.......

Discussion

Una quantità crescente di dati epidemiologici e sperimentali implica infezioni batteriche e virali croniche come possibili fattori di rischio per le malattie neurodegenerative³⁶. L'infezione innesca l'attivazione dei processi infiammatori e delle risposte immunitarie dell'ospite³⁷. Anche se la risposta agisce come meccanismo di difesa, l'infiammazione iperattivata è dannosa per la neurogenesi e l'ambiente infiammatorio non consente la sopravvivenza dei neuroni neonatali

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarosio	Sigma-Aldrich	A6361
Agarosio, bassa temperatura di gelificazione	Sigma-Aldrich	A9414
Drummond Nanoject III Iniettore programmabile di nanolitri	Drummond Scientific	3-000-207
Stereomicroscopi a fluorescenza	Leica	M205 FA
GraphPad Software GraphPad		Software Ver. 7.04
Lipopolisaccaridi da Escherichia coli O111:B4	Sigma-Aldrich	L3024
Micromanipolatore manuale	World Precision Instruments	M3301
Olio minerale	Sigma-Aldrich	M5904
Mx3005P sistema qPCR	Agilent Technologies	Mx3005P
Nanovue plus spettrofotometro	Biochrom	80-2140-46
Kit per il dosaggio della concentrazione di nitriti	Beyotime Biotechnology	S0021M
Soluzione salina tamponata con fosfato	Sigma-Aldrich	P4417
Estrattore per pipette orizzontale programmabile	Precision Instruments	PMP-102
PTU (N-feniltiourea)	Sigma-Aldrich	P7629
Primer casuali	Takara	3802
SuperScript II Trascrittasi inversa	Invitrogen	18064014
SYBR Premix Ex Taq II	kit Biologia accurata	AG11701
I capillari in vetro a parete sottile Tgrinder	Tiangen	OSE-Y30
generazione (4") con filamento, OD 1,5 mm	World Precision Instruments	TW150F-4
Tricaina (estere etilico dell'acido 3-amminobenzoico)	Sigma-Aldrich	A-5040
TRNzol Reagente universale	Tiangen	DP424
Zebrafish tracking box	ViewPoint Behavior Technology